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injection volume은 column의 capasity도 중요하지만 syringe injection 입구와 컬럼 사이에 loop가 있습니다. 그 loop에 보통 최대 injection volume이 표기되어 있습니다. 그 volume의 90% 이하 정도 되는 샘플 volume을 injection하는 것이 좋지요. 예를 들면 20 × 250 mm semi prep 컬럼의 경우 5ml이 maximum이구요, 4.6 x 250mm analytical 컬럼의 경우 0.5ml이 maximum입니다. 위에서 말한 각 컬럼(즉 semiprep과 analytical)의 유속은 각각 14ml/min과 1ml/min가 적절하구요. 이럴 경우에 4~5min이 void volume이 됩니다. 즉 각각 14ml x 4분 = 56ml과 1ml x 4분 = 4ml 정도가 100% 한번 씻어 내는 볼륨(void volume이라고 합니다)이 되지요. 도움이 되셨으면 좋겠습니다.

반갑습니다. prep.에 관해선 경험이 많지 않고 앞서 답변 주신 분이 잘 설명해 주셨기 때문에 생략하고 analytical column에 대해 설명드립니다. 1.컬럼 내경과 길이에 따른 적절한 injection volumn ==> 사실 굉장히 난해한 질문입니다. 보통 분석용 컬럼의 경우 가장 많이 사용하는 것이 10~20uL 입니다. injection volume이라는 것은 사실 시료의 농도에 가장 영향을 많이 받습니다. 농도가 높으면 적은양을 주입해도 컬럼이 감당할 수 있는 분리 한계를 넘어버리기도 하니까요. HPLC에는 샘플루프가 어떤 형태로든 존재합니다. 때문에 샘플루프의 용량한계 내에서 사용할 수 밖에 없습니다. 대부분 10~20uL를 사용하므로 분석 농도도 이것을 기준으로 조절하게 됩니다. 분석 농도는 분석하려고 하는 피크의 분리와 감도를 고려해서 설정하게 됩니다. 2. 컬럼을 100% 한번 씻어 내는데 충분한 볼륨 등 계산하는 법 ==> 보통은 씻어내는 개념이 아니라 같은 말이지만 컬럼의 빈 공간을 채우는데 필요한 부피 입니다. void volume 이라고 하죠. pi x r2 x h 하시면 컬럼 내부 공간의 부피를 알수 있습니다만 이것과 void volume은 다른 개념입니다. 컬럼내부에는 고정상이 채워져 있고 고정상 입자 사이와 고정상 자체가 다공성이기 때문에 그 내부에도 빈 공간이 있습니다. 이를 다 채우는데 필요한 이동상의 부피가 void volume입니다. 따라서 컬럼 내부 빈공간의 물리적 부피보다 void volume이 값이 작습니다. 보통 컬럼의 세척은 void volume을 기준으로 약 20배 가량 흘려주는 것을 원칙으로 합니다. 1 mL/min으로 이동상을 흘려준다고 가정하면 일반적으로 사용하는 id 4.6 mm에 길이 250mm 컬럼의 경우 void volume은 약 2.5~3.0 mL 정도인데....컬럼입자의 크기나 다공도 등에 따라 달라질 수 있습니다. 컬럼의 길이 등 dimension에 따른 세척시간을 일일이 외우는 것은 사실상 어렵습니다. 제 경우엔 유속 1 mL/min으로 씻을 때 길이 150 mm 이상의 컬럼은 1시간, 그 이하는 30분 씻는 것으로 원칙을 세우고 있는데 이정도면 대략 충분히 씻은 것이 됩니다. 더 정확히 하시고 싶다면 chromatogram의 전반부에 나타나는 solvent front(보통 solvent peak이라고 부르기도 합니다)의 RT에 유속을 곱한 값이 그 컬럼의 void volume이라고 생각하시면 되겠습니다. 따라서 이 값에 20배를 흘릴 수 있는 시간을 구하면 되므로 solvent front RT * 20이 되는 시간만큼 흘려주시면 되겠습니다. 3. HPLC 기본 적인 사항을 공부할 수 있는 자료나 컬럼 분석에 대한 자료 ==> 제 개인적으론 Lloyd R. Snyder의 Practical HPLC Method Development라는 책을 추천합니다. 제가 읽은 책 중에 가장 잘 설명되어 있었습니다. 무료로 구할 수 있는 자료는 다음을 참고하시기 바랍니다. a. https://www.chromspec.com/pdf/e/ag34.pdf b. http://www.chromatography-online.org/index.html

컬럼 사실때 딸려오는 몇장 안되는 메뉴얼과 써티에 주입량 계산에 필요한 계수가 포함되어 오는 것으로 알고 있습니다. 각 회사별로 컬럼 내의 돌가루의 크기나 균질도가 다르고 컬럼에 따라 그 성상이 다르기 때문에 회사별로 그리고 컬럼별로 그 계수가 다르다고 하더군요. 하지만 최대주입량을 하더라도 10 ul 이상이 대부분이며 최대 주입량의 차이로 생기는 것은 대상 물질의 분리가 용이해지는 것보다는 컬럼의 수명을 늘려주는 역할 일 뿐이며 더 중요한 것은 부피보다는 시료의 농도가 문제이기 때문에 충분한 감도를 가지고 있으시면 컬럼의 수명이 너무 짧다 싶으실때 주입량을 줄여보시는 것도 나쁘지 않을 것 같습니다.

hplc에 관련한 답변으로 식품공전에 있는 칼럼의 직경에 따른 세척 공식이 나와 잇으니 참고하세요 회사마다 칼럼의 종류재질이 다르므로 각 회사 즉 agilent, waters에 관련 자룔르 확보하심이 좋을듯합니다