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지식나눔

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pET28b vector에 insert 2kb 가 들어가지 않습니다.

2012-10-15 org.kosen.entty.User@56a36751 최영리(sksdudfl)
  • 6
실험을 통해 insert 2kb를 만들었고 e-coli에서 protein 발현을위해 pET28b 와 insert를 ligation 시켜 bl21 com. cell 에 transformation을 시키려고 계속 시도를 하고 있는데요 콜로니는 한개만 떠서 이후 mini prep을 진행해보면 agarose gel 상에서 밴드가 전혀 보이지 않은 상태가 반복되고 있습니다 (insert가 삽입되지 않음). ligation 비율은 insert 30 or 50 : vector 1 BL21에 transformation 시킬때는 제품 프로토콜 대로 ligation 산물 넣고 20분 on ice,1분 30초 heat-shock, 20분 on ice 후 도말하는 방법으로 진행하고 있습니다. 계속 실험을 진행해 보아도 insert가들어가지 않아 고민입니다. insert가 잘 들어갈수 있는 다양한 방법과 의견을 부탁드립니다.
  • transformation
  • ligation
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답변 6
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    엄치용님의 답변

    2012-10-19
    • 3
    귀하께서 진행하시는 실험 상에는 큰 무리가 없어 보입니다. 이상의 결과가 계속 나온다면 일단은 항생제 배지에 문제가 있을 수 있으므로 항생제를 새롭게 구입하여 배지를 새롭게 만드실 것을 권해 드립니다. 다음으로는 만드신 insert DNA가 혹시 PCR을 통해 만드신 것이라면 T-vector에 direct cloning 하신 후에 sequencing하여 올바른 클론인가를 확인한 다음 제한효소로 자른 후에 pET vector로 클로닝하실 수 있습니다. 나오지 않는 결과를 가지고 계속 고민하시기 보다는 새롭게 접근해 보시는 방법도 때로는 도움이 될 수 있습니다. 도움이 되셨길 바랍니다.
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    귀하께서 진행하시는 실험 상에는 큰 무리가 없어 보입니다. 이상의 결과가 계속 나온다면 일단은 항생제 배지에 문제가 있을 수 있으므로 항생제를 새롭게 구입하여 배지를 새롭게 만드실 것을 권해 드립니다. 다음으로는 만드신 insert DNA가 혹시 PCR을 통해 만드신 것이라면 T-vector에 direct cloning 하신 후에 sequencing하여 올바른 클론인가를 확인한 다음 제한효소로 자른 후에 pET vector로 클로닝하실 수 있습니다. 나오지 않는 결과를 가지고 계속 고민하시기 보다는 새롭게 접근해 보시는 방법도 때로는 도움이 될 수 있습니다. 도움이 되셨길 바랍니다.
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    구선우님의 답변

    2012-10-19
    • 3
    insert가 PCR에 의해서 만들어 진것으로 가정 하겠습니다. ligation 에서의 문제는 여러가지가 있을수 있습니다만, background vector (pET28 cut)가 깨끗하게 만들어 졌느냐가 일단 중요 합니다. 문제가 생겼을시 1-2ug정도의 pET28가지고 endonuclease reaction을 하고 2-3번정도 purify를 하면 60-70%정도가 남을 것입니다 (agarose gel purification). 결국 괭장히 sharp한 band를 얻게 되면 어느정도 깨끗하다고 보시면 될것 같습니다. 결론적으로 얼마나 잘 짤렸는냐가 관건이라 할수 있을것 같구요.... Ligation Rxn을 room temp에서 하시는지 아니면 37C 에서 하시는지 ligase 가 T4 DNA Ligase이라면 4C overnight 10ul 그리고 room temp 3시간 10ul 로 나누어 해보셔도 될듯합니다. 더 많은 condition을 주시면 정확한 trouble shooting을 이야기 해볼수도 있을것 같습니다. 그리고 transformation할때 DNA의 양이 적어도 ng range이면 colony의 갯수가 많아야 합니다. 경험상 적어도 15개 이상... (제 경험이므로 절대적이지 않습니다.). ligation (cloning)이 항상 쉬운일이 아니므로 너무 낙담하시지 마시고 계속 condition을 바꾸며 해보싶시요. 보잘것 없는 의견입니다만 도움이 되셨으면 합니다.
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    insert가 PCR에 의해서 만들어 진것으로 가정 하겠습니다. ligation 에서의 문제는 여러가지가 있을수 있습니다만, background vector (pET28 cut)가 깨끗하게 만들어 졌느냐가 일단 중요 합니다. 문제가 생겼을시 1-2ug정도의 pET28가지고 endonuclease reaction을 하고 2-3번정도 purify를 하면 60-70%정도가 남을 것입니다 (agarose gel purification). 결국 괭장히 sharp한 band를 얻게 되면 어느정도 깨끗하다고 보시면 될것 같습니다. 결론적으로 얼마나 잘 짤렸는냐가 관건이라 할수 있을것 같구요.... Ligation Rxn을 room temp에서 하시는지 아니면 37C 에서 하시는지 ligase 가 T4 DNA Ligase이라면 4C overnight 10ul 그리고 room temp 3시간 10ul 로 나누어 해보셔도 될듯합니다. 더 많은 condition을 주시면 정확한 trouble shooting을 이야기 해볼수도 있을것 같습니다. 그리고 transformation할때 DNA의 양이 적어도 ng range이면 colony의 갯수가 많아야 합니다. 경험상 적어도 15개 이상... (제 경험이므로 절대적이지 않습니다.). ligation (cloning)이 항상 쉬운일이 아니므로 너무 낙담하시지 마시고 계속 condition을 바꾸며 해보싶시요. 보잘것 없는 의견입니다만 도움이 되셨으면 합니다.
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    김성훈님의 답변

    2012-10-19
    • 2

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    아마 ligation이 잘 되지 않는 이유의 핵심은 competent cell을 바로 B strain인 BL21을 쓰셔서 그럴 겁니다. 이유는 genetic back ground가 다르기 때문이죠.. BL21을 쓰기 전에 모든 construction vector는 DH5alpa나 B strain유래가 아닌 다른 strain에서 재조합 플라스미드를 만드신 후 miniprep을 해서 플라스미드를 얻은 후에 최종적으로 발현을 위해 BL21에 넣어야 합니다. 질문하신 분의 실험이 안되는 이유가 제가 예상한 것이 맞다면 실험을 해보시고 결과를 RE로 달아주시면 감사드리겠습니다.
    답변수정
    아마 ligation이 잘 되지 않는 이유의 핵심은 competent cell을 바로 B strain인 BL21을 쓰셔서 그럴 겁니다. 이유는 genetic back ground가 다르기 때문이죠.. BL21을 쓰기 전에 모든 construction vector는 DH5alpa나 B strain유래가 아닌 다른 strain에서 재조합 플라스미드를 만드신 후 miniprep을 해서 플라스미드를 얻은 후에 최종적으로 발현을 위해 BL21에 넣어야 합니다. 질문하신 분의 실험이 안되는 이유가 제가 예상한 것이 맞다면 실험을 해보시고 결과를 RE로 달아주시면 감사드리겠습니다.
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    강용석님의 답변

    2012-10-19
    • 0
    위에 적힌 의견들 모두 참고할 만하며 좋은 생각들을 많이 담아 주셔서 프로토콜 확인차 한 가지 의견만 드려 봅니다. 저는 PCR-enzyme cut-ligation으로 클로닝 진행시 heat shock을 준 후 antibiotics가 들어있지 않은 배지를 튜브에 1ml 가량 첨가하여 shaking incubator (37C, 150 rpm 정도)에서 30~60 min 배양한 뒤에 antibiotics가 들어있는 배지에 도말하였습니다. enzyme cut 후 ligation된 DNA에는 nick이 존재하여 transformation되더라도 제대로 항생제저항성 유전자가 발현되기까지는 시간이 다소 걸리는 것 때문에 위의 과정을 거친다는 점은 아마 알고 계실 것 같으나 혹시나 하여 의견 첨가하였습니다. 그리고 콜로니가 너무 적게 뜬 것은 일단 insert없이 vector만 ligation된 것도 거의 없단 얘기인데, 이런 경우 뜬 콜로니는 그냥 contamn에 의하여 발생한 콜로니이고, 그 결과 아무 밴드도 안 뜨는 경우를 경험해 본 적이 있습니다. 컨트롤 실험으로 insert없이 잘린 vector만으로 ligation 반응을 진행해 보세요.. 이 경우 콜로니가 수두룩 빽빽하게 차야 정상일 것입니다.
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    위에 적힌 의견들 모두 참고할 만하며 좋은 생각들을 많이 담아 주셔서 프로토콜 확인차 한 가지 의견만 드려 봅니다. 저는 PCR-enzyme cut-ligation으로 클로닝 진행시 heat shock을 준 후 antibiotics가 들어있지 않은 배지를 튜브에 1ml 가량 첨가하여 shaking incubator (37C, 150 rpm 정도)에서 30~60 min 배양한 뒤에 antibiotics가 들어있는 배지에 도말하였습니다. enzyme cut 후 ligation된 DNA에는 nick이 존재하여 transformation되더라도 제대로 항생제저항성 유전자가 발현되기까지는 시간이 다소 걸리는 것 때문에 위의 과정을 거친다는 점은 아마 알고 계실 것 같으나 혹시나 하여 의견 첨가하였습니다. 그리고 콜로니가 너무 적게 뜬 것은 일단 insert없이 vector만 ligation된 것도 거의 없단 얘기인데, 이런 경우 뜬 콜로니는 그냥 contamn에 의하여 발생한 콜로니이고, 그 결과 아무 밴드도 안 뜨는 경우를 경험해 본 적이 있습니다. 컨트롤 실험으로 insert없이 잘린 vector만으로 ligation 반응을 진행해 보세요.. 이 경우 콜로니가 수두룩 빽빽하게 차야 정상일 것입니다.
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    차민호님의 답변

    2012-10-21
    • 0

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    앞서 의견들이 모두 맞는 얘기들입니다. 개인적인 경험으로는 trouble shooting과 시간의 절약을 위해서 envitech님의 의견에 따라 BL21이 아닌 DH5a등 다른 cloning용 host를 먼저 사용하는 것을 추천합니다. 동시에, swkoo71님과 kyongdol님의 말씀대로 공 vector control 실험을 해보면, vector cutting 및 ligation 실험을 병행해서 진행하면 도움이 됩니다. 그래도 안된다면, 가장 느리지만 확실한 방법은 cyeom1님께서 추천해 주신 T-vector를 사용하는 방법입니다. 1차적 육안 식별이 가능하여 보다 확신을 가지시고 진행하실 수 있습니다. 다만, 모든 경우에서 앞서 envitech님의 의견대로 BL21을 사용하는 것보다 먼저 Cloning용 host를 사용하는 것이 더 좋습니다
    답변수정
    앞서 의견들이 모두 맞는 얘기들입니다. 개인적인 경험으로는 trouble shooting과 시간의 절약을 위해서 envitech님의 의견에 따라 BL21이 아닌 DH5a등 다른 cloning용 host를 먼저 사용하는 것을 추천합니다. 동시에, swkoo71님과 kyongdol님의 말씀대로 공 vector control 실험을 해보면, vector cutting 및 ligation 실험을 병행해서 진행하면 도움이 됩니다. 그래도 안된다면, 가장 느리지만 확실한 방법은 cyeom1님께서 추천해 주신 T-vector를 사용하는 방법입니다. 1차적 육안 식별이 가능하여 보다 확신을 가지시고 진행하실 수 있습니다. 다만, 모든 경우에서 앞서 envitech님의 의견대로 BL21을 사용하는 것보다 먼저 Cloning용 host를 사용하는 것이 더 좋습니다
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    성기문님의 답변

    2012-10-22
    • 0
    앞선 분들께서 많은 얘기를 해 주셨는데요... 덧붙여서 몇마디 거들겠습니다. 통상 단백질 발현을 위해 사용하는 미생물 균주와 DNA subcloning을 위해 사용하는 미생물균주가 조금 다릅니다. 같은 E.coli라 하더라도 말이죠. 즉, DH5alpha 와 같은 strain은 genetic background를 확인해 보시면 endonuclease와 같은 DNA분해 효소가 없이 만들어져 있어 DNA subcloning 확인해 적합한 반면, BL21 strain의 경우는 이런 endonuclease는 정상적이고 단백질이 합성이 용이하게끔 변화시킨 균주입니다. 다시말하면, 실험자께서 subcloning후에 transformed colony에서 DNA를 추출해서 확인해도 아마 enodogenous endonuclease에 의해서 DNA 대부분이 degradation 되기 때문에 agarose상에서 확인이 안되는게 정상적인 것입니다. 일단 ligated products를 DH5alpha strain에 trasformation한 후 restricition enzyme으로 확인하시고 BL21으로 넘기신다음 induction시켜 lysates상에서 대강의 크기로 확인하셔야 할 것 같습니다. 참고로, pET28 vector는 6xhis tagging인데, GST fusion과 달리 사이즈에서 큰 차이가 없어서 induction정도가 잘 안보이면 purification단계까지 가야만 확인이 가능합니다. 따라서, subcloning이 codon에 맞게 되었는지 sequencing도 필요하고, 또 혹시 expression시키실 단백질이 high eukaryotic gene이라면 codon usage가 적정한지도 확인하셔야 할 듯 싶습니다. 여러가지 확인해 보시고 꼭 성공하시길 바랍니다...
    답변수정
    앞선 분들께서 많은 얘기를 해 주셨는데요... 덧붙여서 몇마디 거들겠습니다. 통상 단백질 발현을 위해 사용하는 미생물 균주와 DNA subcloning을 위해 사용하는 미생물균주가 조금 다릅니다. 같은 E.coli라 하더라도 말이죠. 즉, DH5alpha 와 같은 strain은 genetic background를 확인해 보시면 endonuclease와 같은 DNA분해 효소가 없이 만들어져 있어 DNA subcloning 확인해 적합한 반면, BL21 strain의 경우는 이런 endonuclease는 정상적이고 단백질이 합성이 용이하게끔 변화시킨 균주입니다. 다시말하면, 실험자께서 subcloning후에 transformed colony에서 DNA를 추출해서 확인해도 아마 enodogenous endonuclease에 의해서 DNA 대부분이 degradation 되기 때문에 agarose상에서 확인이 안되는게 정상적인 것입니다. 일단 ligated products를 DH5alpha strain에 trasformation한 후 restricition enzyme으로 확인하시고 BL21으로 넘기신다음 induction시켜 lysates상에서 대강의 크기로 확인하셔야 할 것 같습니다. 참고로, pET28 vector는 6xhis tagging인데, GST fusion과 달리 사이즈에서 큰 차이가 없어서 induction정도가 잘 안보이면 purification단계까지 가야만 확인이 가능합니다. 따라서, subcloning이 codon에 맞게 되었는지 sequencing도 필요하고, 또 혹시 expression시키실 단백질이 high eukaryotic gene이라면 codon usage가 적정한지도 확인하셔야 할 듯 싶습니다. 여러가지 확인해 보시고 꼭 성공하시길 바랍니다...
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