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HPLC column 관련 문의

2013-03-04 org.kosen.entty.User@476b64fd 신학섭(guguban)
  • 2
안녕하세요... HPLC 초보입니다. 제가 요즘 HPLC를 하고 있는데요.. 동물 조식 samples을 이용해서요. 그런데 같은 samples에서 보려는 metabolite 종류별로 column conditions이 달라서요. 잘모르기 때문에 논문을 참고 하고 있는데. 하나는 C18 100mm x 4.6ID, 3.5um를 사용하였고, 또 다른 물질은 polypore H 220mm x 4.6ID, 10um를 사용하더라구요...ㅡㅡ. 그럼 이동상용매도 KHPO4와 H2SO4로 다르고요... 그럼 원하는 물질을 보기 위해서는 column을 두개 준비해야 되나요?? 아니면 column을 하나만 하고 용매만 바꿔줘도 되나요???
  • HPLC
  • column
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  • 답변

    조윤환님의 답변

    2013-03-04
    • 0
    반갑습니다. 일단 관찰하고자 하는 대사산물이 여러가지인데.....각 대사산물 별로 알려져 있는 분석 조건이 모두 다르다는 말씀이군요. 기존에 알려져 있는 분석조건을 이용할 계획이라면 대사산물의 종류만큼 컬럼도 있어야 합니다. 하지만 관심 성분을 한 컬럼으로 한꺼번에 분석하고자 한다면 별도의 실험을 통해 동시 분석이 가능한 분석조건을 확립해야 합니다. 물론 동시분석 사례가 있다면 별도로 분석조건을 확립하지 않아도 되겠지만요. 질문에서 언급한 컬럼은 일반적인 역상컬럼과 이온크로마토그래피용 컬럼으로 분리 메커니즘 자체가 틀리기 때문에 어느 한 컬럼으로 관찰하고자 하는 성분 모두를 만족할만한 수준으로 분리하기 어려울 가능성이 높아 보입니다. 분석 경험이 많으시다면 여러 문헌을 참고해서 동시 분석 조건 설계하실 수 있겠지만, 그렇지 못하시다니 어려움이 예상됩니다. 행운을 빕니다.
    답변수정
    반갑습니다. 일단 관찰하고자 하는 대사산물이 여러가지인데.....각 대사산물 별로 알려져 있는 분석 조건이 모두 다르다는 말씀이군요. 기존에 알려져 있는 분석조건을 이용할 계획이라면 대사산물의 종류만큼 컬럼도 있어야 합니다. 하지만 관심 성분을 한 컬럼으로 한꺼번에 분석하고자 한다면 별도의 실험을 통해 동시 분석이 가능한 분석조건을 확립해야 합니다. 물론 동시분석 사례가 있다면 별도로 분석조건을 확립하지 않아도 되겠지만요. 질문에서 언급한 컬럼은 일반적인 역상컬럼과 이온크로마토그래피용 컬럼으로 분리 메커니즘 자체가 틀리기 때문에 어느 한 컬럼으로 관찰하고자 하는 성분 모두를 만족할만한 수준으로 분리하기 어려울 가능성이 높아 보입니다. 분석 경험이 많으시다면 여러 문헌을 참고해서 동시 분석 조건 설계하실 수 있겠지만, 그렇지 못하시다니 어려움이 예상됩니다. 행운을 빕니다.
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  • 답변

    배기현님의 답변

    2013-03-06
    • 0

    첨부파일

    안녕하세요 분석하고자 하는 metabolite 종류별로 column condition이 다른 경우이군요. 먼저 윗분께서 말씀하신 대로 C18 컬럼은 역상컬럼, polypore H는 이온크로마토그래피용 컬럼입니다. 특히 polypore H는 organic acid 계열을 분리하는데 쓰이기 때문에 이 컬럼을 이용해서 비전하성/양이온성 metabolite를 분리하기는 어렵습니다. 첫번째, 문헌대로 column을 두 개 준비하는 것이 정석입니다만, 컬럼 구매 비용이 꽤 들고 한 가지 HPLC 시스템으로 두 가지 컬럼을 쓰려면 washing step에 꽤 많은 시간이 들어갑니다. 두번째, column을 하나만 하고 용매만 바꿔주는 방법은 역시 washing step에 시간이 많이 들고 컬럼 성질에 적합하지 않은 용매를 쓸 경우 column에 손상을 줄 수 있습니다. 혹시 분석하고자 하는 시료(metabolite)를 Sigma나 Merck, TCI 등에서 구할 수 있는지요? 만약에 구할 수만 있다면, 그것을 standard로 삼아서 한 가지 컬럼에서 분석할 수도 있다고 생각이 듭니다. (혹시 구입할 수 있는 물질이 아니라면, 기존 문헌의 교신 저자에게 연락을 드려보세요. 보통 LC를 통해서 분리를 했다면 연구 목적으로 보관하고 있는 경우가 많습니다. 연구에 필요한 어느 정도 양의 원료는 받을 수 있을지도 모릅니다.) 이 때 사용하실 수 있는 컬럼은 역상컬럼, C18 컬럼입니다. 위에서 말씀드린 것처럼 polypore H는 음이온성 organic acid 계열 외 다른 물질을 분석하기 어렵습니다. 제 경험상, 대부분의 시료들은 적거나 많게 hydrophobicity를 지니고 있기 때문에 C18 컬럼을 이용하시면 거의 대부분의 metabolite를 분석하실 수 있을 겁니다. 다시 말씀드리면, polypore H에서 분석하려는 물질 원료를 구할 수만 있다면, C18 컬럼에 이동상용매(KHPO4)를 흘려주면서 그 물질을 주입하여 elution time을 얻습니다. (한 가지 주의하실 점은, 이 때 얻어지는 elution time이 분석하고자 하는 다른 metabolite의 elution time과 겹치지 않아야 분석이 가능합니다.) 그 물질의 양을 바꾸어주면서 Absorbance vs. concentration curve를 얻습니다. 만약에 curve가 linear하고 R2 값이 0.95~1 정도로 나온다면, 해당 물질의 정량적 분석이 가능하다는 뜻입니다. 도움이 되었으면 좋겠네요.
    답변수정
    안녕하세요 분석하고자 하는 metabolite 종류별로 column condition이 다른 경우이군요. 먼저 윗분께서 말씀하신 대로 C18 컬럼은 역상컬럼, polypore H는 이온크로마토그래피용 컬럼입니다. 특히 polypore H는 organic acid 계열을 분리하는데 쓰이기 때문에 이 컬럼을 이용해서 비전하성/양이온성 metabolite를 분리하기는 어렵습니다. 첫번째, 문헌대로 column을 두 개 준비하는 것이 정석입니다만, 컬럼 구매 비용이 꽤 들고 한 가지 HPLC 시스템으로 두 가지 컬럼을 쓰려면 washing step에 꽤 많은 시간이 들어갑니다. 두번째, column을 하나만 하고 용매만 바꿔주는 방법은 역시 washing step에 시간이 많이 들고 컬럼 성질에 적합하지 않은 용매를 쓸 경우 column에 손상을 줄 수 있습니다. 혹시 분석하고자 하는 시료(metabolite)를 Sigma나 Merck, TCI 등에서 구할 수 있는지요? 만약에 구할 수만 있다면, 그것을 standard로 삼아서 한 가지 컬럼에서 분석할 수도 있다고 생각이 듭니다. (혹시 구입할 수 있는 물질이 아니라면, 기존 문헌의 교신 저자에게 연락을 드려보세요. 보통 LC를 통해서 분리를 했다면 연구 목적으로 보관하고 있는 경우가 많습니다. 연구에 필요한 어느 정도 양의 원료는 받을 수 있을지도 모릅니다.) 이 때 사용하실 수 있는 컬럼은 역상컬럼, C18 컬럼입니다. 위에서 말씀드린 것처럼 polypore H는 음이온성 organic acid 계열 외 다른 물질을 분석하기 어렵습니다. 제 경험상, 대부분의 시료들은 적거나 많게 hydrophobicity를 지니고 있기 때문에 C18 컬럼을 이용하시면 거의 대부분의 metabolite를 분석하실 수 있을 겁니다. 다시 말씀드리면, polypore H에서 분석하려는 물질 원료를 구할 수만 있다면, C18 컬럼에 이동상용매(KHPO4)를 흘려주면서 그 물질을 주입하여 elution time을 얻습니다. (한 가지 주의하실 점은, 이 때 얻어지는 elution time이 분석하고자 하는 다른 metabolite의 elution time과 겹치지 않아야 분석이 가능합니다.) 그 물질의 양을 바꾸어주면서 Absorbance vs. concentration curve를 얻습니다. 만약에 curve가 linear하고 R2 값이 0.95~1 정도로 나온다면, 해당 물질의 정량적 분석이 가능하다는 뜻입니다. 도움이 되었으면 좋겠네요.
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