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지식나눔

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ELISA 실험 초보자입니다

2013-03-22 org.kosen.entty.User@7d6e1154 강필성(love3233)
  • 2
ELISA를 처음하는 초보자입니다. GST 유전자를 삽입하여 발현량을 측정하기 위해, thermo pierce glutathione coated 96-Well plate (white, 96-well; cat # 15240), primary (cat # cab5001), scondary (NCI1430KR) antibody, TMB (cat # 34021)를 같이 구입 했고 purified GST (cat # Z02039)는 GenScript에서 구입 했습니다. 선행실험으로 purified GST를 가지고 실험한 결과 값이 일정하게 나오지 않았습니다. purified GST를 농도 별로도 해봤습니다. 그래서 thermo pierce에 문의 해 봤는데 96-well plate를 잘 못 구입 했다고 하네요. 왜 그런지 다시 문의를 했는데 white는 TMB로 반응을 시키는게 아니라 다른 제품으로 반응을 시켜야 한다고 합니다. 그래서 white에선 어떤 반응 시약으로 해야 하는지와 TMB에 맞는 plate가 무엇인지 다실 문의를 했었습니다. white에 맞는 반응 시약은 (supersignal ELISA pico chemiluminescent substrate; cat # 37070)이고 가격을 적당하다고 생각은 되지만 실험실에 있는 plate reader기에 안 맞고, Glutathione coate 96-Well plate (clear, 96-well; cat # 15140B)는 소량 (5 plate)으로 구입이 안되고 대량 (최소 50 plate 정도)만 구입이 된다고 하네요. 제가 궁금한 건 thermo사에서 구입한 Ab, TMB와 GE healcare에 GST 96-Well detection module 제품으로 분석이 가능한지입니다. 그리고 또 걱정은 계속 실험을 실패를 해서 module를 구입해도 잘 될지가 걱정입니다. 이 부분에 대해 GE에 문의를 해 봤는데 잘 모르겠다는 답이 왔습니다. 그리고 혹시나 해서 plate sample을 구할수 있냐고 물어 봤는데 역시나 불가능하다고 답이 왔습니다. 처음부터 잘못된 set-up이라 스트레스가 장난이 아니네요...ㅠㅠ
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답변 2
  • 답변

    배기현님의 답변

    2013-03-23
    • 0

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    안녕하세요 ELISA 때문에 고민하고 계시는군요. 결론부터 말씀드리면, GE Healthcare의 GST 96-Well Detection Module 제품과 Thermo사의 Soluble TMB Substrates(cat # 34021)를 같이 사용하셔도 분석이 가능합니다. 하지만 Thermo사에서 구입한 Ab는 혼용하지 않으시는 게 좋겠습니다. 각각의 이유는 아래에 설명드립니다. 1. TMB는 Tetramethylbenzidine이라는 화합물이라 회사에 상관없이 동일합니다. 다만 어떤 회사는 TMB를 Peroxide와 혼합된 형태로 판매하고, 어떤 회사는 분리된 형태로 판매합니다. Thermo사의 Soluble TMB Substrates(cat # 34021)는 프로토콜을 확인해보니 TMB Solution과 Peroxide Solution을 분리해놓고 사용 직전에 1:1 부피 비율로 섞어서 사용하도록 해놓았네요. 프로토콜에 적힌 대로 TMB/Peroxide 넣은 후에 stop solution까지 넣어서 450 nm의 흡광도(yellow color가 발색되는 정도)를 분석하시면 됩니다. 참고로 TMB를 넣고 반응시킬 때에는 가능하면 밝은 빛을 쪼이지 않는 것이 좋습니다. 쿠킹호일 같은 것으로 ELISA plate 위를 살짝 덮어서 어둡게 만들어주세요. 2. GE Healthcare의 GST 96-Well Detection Module 제품은 이미 HRP/anti-GST conjugate 라고 불리는 antibody를 포함하고 있습니다. 이 항체는 anti-GST antibody에 HRP enzyme까지 붙인 형태라, 추가적인 항체가 필요가 없습니다. 따라서 Thermo사의 Ab는 사용하지 않으셔도 됩니다. 참고로 standard protein의 경우에도 GE Healthcare의 GST 96-Well Detection Module 제품에 포함된 Recombinant Glutathione S-transferase test protein을 사용하시는 것을 추천드립니다. 물론 GenScript에서 구입하신 purified GST (cat # Z02039)를 사용하셔도 되지만 이미 확실하게 검증되어 kit에 포함된 standard protein을 사용하시는 것이 더 나을 것 같습니다. 추가적으로 말씀드리면, 선행실험에서는 white 96-Well plate를 쓰셨기 때문에 측정값이 일정하게 나오지 않았었던 것 같습니다. white 96-Well plate는 바닥이 하얀 플라스틱으로 막혀서 빛이 투과하지 못하기 때문에 TMB를 이용한 흡광도 측정이 제대로 되지 않았을 겁니다. 보통 white나 black plate는 형광 실험에 이용되는 ELISA plate 입니다. 그것은 각 well이 빛이 투과하지 않는 플라스틱 벽으로 분리되어 있어서 서로 다른 well에 들어있는 샘플의 형광이 서로 간섭하지 않기 때문입니다. 제 생각에는 GE Healthcare의 GST 96-Well Detection Module 제품을 사용하시고, TMB만 Thermo사의 Soluble TMB Substrates(cat # 34021)제품을 사용하시면 원하시는 단백질을 분석하시는 데 문제없을 것 같습니다. 자세한 방법은 각 프로토콜에 잘 나와있네요 (첨부 참조).
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    안녕하세요 ELISA 때문에 고민하고 계시는군요. 결론부터 말씀드리면, GE Healthcare의 GST 96-Well Detection Module 제품과 Thermo사의 Soluble TMB Substrates(cat # 34021)를 같이 사용하셔도 분석이 가능합니다. 하지만 Thermo사에서 구입한 Ab는 혼용하지 않으시는 게 좋겠습니다. 각각의 이유는 아래에 설명드립니다. 1. TMB는 Tetramethylbenzidine이라는 화합물이라 회사에 상관없이 동일합니다. 다만 어떤 회사는 TMB를 Peroxide와 혼합된 형태로 판매하고, 어떤 회사는 분리된 형태로 판매합니다. Thermo사의 Soluble TMB Substrates(cat # 34021)는 프로토콜을 확인해보니 TMB Solution과 Peroxide Solution을 분리해놓고 사용 직전에 1:1 부피 비율로 섞어서 사용하도록 해놓았네요. 프로토콜에 적힌 대로 TMB/Peroxide 넣은 후에 stop solution까지 넣어서 450 nm의 흡광도(yellow color가 발색되는 정도)를 분석하시면 됩니다. 참고로 TMB를 넣고 반응시킬 때에는 가능하면 밝은 빛을 쪼이지 않는 것이 좋습니다. 쿠킹호일 같은 것으로 ELISA plate 위를 살짝 덮어서 어둡게 만들어주세요. 2. GE Healthcare의 GST 96-Well Detection Module 제품은 이미 HRP/anti-GST conjugate 라고 불리는 antibody를 포함하고 있습니다. 이 항체는 anti-GST antibody에 HRP enzyme까지 붙인 형태라, 추가적인 항체가 필요가 없습니다. 따라서 Thermo사의 Ab는 사용하지 않으셔도 됩니다. 참고로 standard protein의 경우에도 GE Healthcare의 GST 96-Well Detection Module 제품에 포함된 Recombinant Glutathione S-transferase test protein을 사용하시는 것을 추천드립니다. 물론 GenScript에서 구입하신 purified GST (cat # Z02039)를 사용하셔도 되지만 이미 확실하게 검증되어 kit에 포함된 standard protein을 사용하시는 것이 더 나을 것 같습니다. 추가적으로 말씀드리면, 선행실험에서는 white 96-Well plate를 쓰셨기 때문에 측정값이 일정하게 나오지 않았었던 것 같습니다. white 96-Well plate는 바닥이 하얀 플라스틱으로 막혀서 빛이 투과하지 못하기 때문에 TMB를 이용한 흡광도 측정이 제대로 되지 않았을 겁니다. 보통 white나 black plate는 형광 실험에 이용되는 ELISA plate 입니다. 그것은 각 well이 빛이 투과하지 않는 플라스틱 벽으로 분리되어 있어서 서로 다른 well에 들어있는 샘플의 형광이 서로 간섭하지 않기 때문입니다. 제 생각에는 GE Healthcare의 GST 96-Well Detection Module 제품을 사용하시고, TMB만 Thermo사의 Soluble TMB Substrates(cat # 34021)제품을 사용하시면 원하시는 단백질을 분석하시는 데 문제없을 것 같습니다. 자세한 방법은 각 프로토콜에 잘 나와있네요 (첨부 참조).
    등록된 댓글이 없습니다.
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    배기현님의 답변

    2013-03-25
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    윗글을 남긴 후에야 새로운 module을 구입하지 않아도 된다는 것을 깨달았습니다. 현재 갖고 계신 white 96-Well plate을 이용하여 ELISA를 진행하시고요, 프로토콜 대로 TMB/Peroxide 용액을 넣은 후에 incubation하시고 마지막으로 Stop solution까지 넣어줍니다. 이 때 각 용액의 양이 100 마이크로리터이기 때문에 총량은 200 마이크로리터가 됩니다. 여기서 multichannel pipette으로 모든 용액을 100 마이크로리터씩 보통의 clear 96-well plate로 옮겨줍니다. 그리고 microplate reader에서 450 nm의 흡광도를 분석하시면 됩니다. 앞서 답변을 드렸듯이 선행실험에서 사용하신 white 96-Well plate는 빛이 투과하지 못하기 때문에 흡광도 측정이 제대로 되지 않습니다. 그래서 Stop soltion을 넣어서 발색과정이 끝난 후에 용액만 다른 일반 plate로 옮겨서 흡광도 측정을 하시면 됩니다.
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    윗글을 남긴 후에야 새로운 module을 구입하지 않아도 된다는 것을 깨달았습니다. 현재 갖고 계신 white 96-Well plate을 이용하여 ELISA를 진행하시고요, 프로토콜 대로 TMB/Peroxide 용액을 넣은 후에 incubation하시고 마지막으로 Stop solution까지 넣어줍니다. 이 때 각 용액의 양이 100 마이크로리터이기 때문에 총량은 200 마이크로리터가 됩니다. 여기서 multichannel pipette으로 모든 용액을 100 마이크로리터씩 보통의 clear 96-well plate로 옮겨줍니다. 그리고 microplate reader에서 450 nm의 흡광도를 분석하시면 됩니다. 앞서 답변을 드렸듯이 선행실험에서 사용하신 white 96-Well plate는 빛이 투과하지 못하기 때문에 흡광도 측정이 제대로 되지 않습니다. 그래서 Stop soltion을 넣어서 발색과정이 끝난 후에 용액만 다른 일반 plate로 옮겨서 흡광도 측정을 하시면 됩니다.
    배기현(bkheun82) 2014-01-27

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    강필성(love3233) 2014-01-28

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