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재료의 전처리>고정>연화>염색>현미경관찰☞저▶고배율 예시 파의염색체분석 2mM oxyquinoline에서 18도 6시간 전처리후 carnoy sol(3:1,에탄올:빙초산)에서 상온 2시간 내외 고정 1N HCl 1분 내외 연화후 Aceto orcein 1% 1-2분 염색후 현미경 관찰 Levan - 염색체의 형태를 분류 metacentric,submetacentric, telocentric 동원체의위치에따라 분류 공기건조법- 염색하기 전단계 전처리- 고정 - 연화- 건조 Giemsa stain 을 위한 좀더 복잡한 처리 전처리6시간 후 고정2시간 연화15초에서1분이내한다음 Slideglass위에 샘플을 올려놓은뒤커버글라스덮고 두드려 세포를 편평하게 펼친다음 하루동안 건조시키는 것을 말함. 폰으로 작성한 관계로 미비합니다 메일 kjh8911@korea.kr 연락주세요.

배양한 사람 혈액으로부터 염색체 표본을 만들어 분석하는 핵형분석 방법 A) 배양 : 멸균 용기와 기술 필요하고 protocol은 일반적인 실험서에서 볼 수 있다. 요점은 헤파린 처리된 정맥혈 10 ml 정도에서 유핵세포인 백혈구를 분리하여 PHA(phytohem-agglutinin)을 포함한 배양액(RPMI + 10% FBS + antibiotics)에 넣어 배양기에서 2-3일 정도 배양한다. 배양이 끝나기 2시간 전에 방추사 억제물질인 콜히친 (또는 콜세미드나 빈브라스틴)을 처리한다. *PHA는 일시적 세포분열유도물질로 사용됨. B) 배양세포 수거 및 고정 : 멸균과정이 필요없음. 원심분리로 세포를 수거하고 저장액(0.075 M KCl)을 처리하여 세포막이 터지게 한다. * 핵막이 터지지 않을 정도로 하는 것이 중요함. 이를 고정액(3:1 absolute Methanol : glacial acetic acid)으로 처리하는데 요점은 원심분리한 세포 용액 0.1 -0.2 ml에 8 - 10 ml의 새로 제조한 고정액을 방울방울 떨어뜨리면서 잘 섞이도록 흔들어 준다. 이 과정을 반복한 후 최종적으로 원심분리하여 밑에 가라앉은 0.05 -0.1 ml의 세포용액을 고정액으로 희석한 후 슬라이드 표본을 만든다. C) 슬라이드 제작 : air drying method 잘 세척되고 absolute methanol에 보관된 슬라이드를 사용한다. 엄지와 검지 손가락으로 슬라이드를 잡고 25 - 30 cm 높이에서 스포이드로 상기 세포용액을 2 - 3 방울을 슬라이드 중앙부위에 떨어뜨리고 숨바람으로 후 불어 퍼져 나가기 쉽게 한 후 공기 중에서 건조시킨다. * 이때 burn technique이라 하여 알콜램프 불길 위에서 조심스럽게 건조시키는 방법이 더 많이 사용된다. 이 방법은 통상적인 커버글라스를 덮은 후 위에서 눌러 핵막을 터뜨려 핵내에 있는 염색체들이 퍼지게 하는 방법보다 공기건조법은 액체 상에서 퍼지게 하는 힘에 의해 핵막이 터져 그안의 염색체들 멀리 가지 않고 잘 보이게 하는 장점을 지니고있다. 염색하기 전에 2 - 3 시간 정도 더 건조시킨 후에 Giemsa 염색을 한 다음 세포분열중기 염색체상을 현미경으로 관찰한다. D) 염색체 분석법 사람의 염색체가 정상인의 경우 46개라는 것이 밝혀진 것은 스웨덴의 Lund 대학의 Tijo & Levan(1956)에 의해서이다. 1959년 염색체의 이상에 의해 Down syndrome (mongolism)이 생긴다는 것이 밝혀진 후 인류유전학과 의학유전학 분야에서 세포유전학이 탄생하게 되었다. 이런 염색체 세포유전학은 현재에 와서는 분자세포유전학의 발전으로 이어지고 있다. 핵형분석은 염색체의 구조 및 수적 성상의 변화가 일어났는지를 분석하는 것으로 산전진단, 암진단 등에 활용되고 있다. 사람 염색체의 명명과 분류에 대한 규약이 국제인류염색체학회에서 설정되어 사용되고 있는데 1960년 미국 콜로라도주 Denver에서 A Proposed Standard System of Nomenclature of Human Mitotic Chromosomes가 제시되고 이어서 1963년에 The London Conference on the Normal Human Karyotype에 대한 것이 발표되었고 1966년 Chicago Conference에서 보고된 것으로 Nomenclature(명명, 예, A-G: 염색체 그룹 p: 염색체의 단완, t: 전좌 등 심볼을 기재), Numerical aberrations(염색체 수적 이상, 45, X; 45개 염색체,한개의 X 염색체 등등), Structural aberrations(구조적 이상, 46,XY,t(Bp-;Dq+). B 그룹 단완과 D그룹 염색체의 장완 사이의 상호전좌) 등이 기재되었다. * Birth defects Original Article Series; Chicago Conference, 1966 Vol II, No 2 The National Foundation- March of Dimes. 참조. 초기의 논문들로 Redding A and K Hirschhorn, 1968. Guide to human chromosome defects. Birth Defects Original Article Series Vol 4, No 4. Croce, CM and G Klein, Chromosome translocations and human Cancer. Scientific American 읓 참조하기 바람. E) 분염법(banding technique) : 통상적인 김자 염색법 외에 염색체에 밴드가 나타나게 함 G-banding, C-banding, Q-banding, R-banding 등이 목적에 따라 각기 사용된다. 분염법에 대해서는 Paris Conference (1971)의 "Standardization in Human Cytogenetics"와 그 이전 및 이후의 Conference 등에서 표준화 작업이 이루어졌다. F) Levan et al(1964)의 계수법은 상기 D)를 참조.