2013-09-24
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이대훈(ldhoonlb)
- 4
당단백질 정제를 진행하고 있는 초보석사과정생입니다.
지금, sepharose 컬럼을 이용하여 시료를 정제하여 2개의 fraction을 얻었습니다.
정제시 사용된 용매가 2M NaCl이라 염을 제거 해야해서, 1000MW의 투석막을 이용하여 3일간
투석(외부에 물을두고, 투석막을 스틸러를 통해 저어줌)한 후 동결건조하고 나니, loading 한 시료양보다 더 많은 무게가 측정되었으며,
분석결과에서도 농도를 맞춰 희석하여 분석하니 오히려 당이 정제전보다 줄어들었습니다..
그래서 문제점으로, 제생각으로는 투석시 투석막의 분자량이 너무 작아서 염이 완전히 제거되지 못한듯 한데... 보통 단백질 정제후 투석하는 방법에 관해 전문가분들의 조언 부탁드립니다^^
- dialysis
- nacl 제거
- 정제
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 4
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답변
이상후님의 답변
2013-09-26- 5
탈염과정도 일종의 정제 과정입니다. 당연히 정제과정이 늘어날수록 샘플의 양은 줄어들게 되어 있습니다. 사실 dialysis 팩을 사용하는 방법이 간편하고 비용절감 방법으로 가장 좋은 방법입니다. 질문자분께서 dialysis를 적용하신건 잘 하신거 같습니다만, dialysis시에 주의할 점이 있습니다. 우선 적당 길이의 dialysis 팩을 자른 후에 클립퍼로 한쪽 끝을 blocking 시킨 후에, 시료를 넣고 물은 담은 수조에 반쯤 담가서 시료가 누수가 일어나는지(시료가 누수가 일어날 경우 마치 아지랑이가 일어나는 듯한 현상이 관찰됨) 반드시 확인해야 됩니다. 제 경험상으로도 클립퍼를 고정했지만 실제로 dialysis하는 동안 blocking이 제대로 되지 않아서 샘플 손실이 일어난 경우가 있습니다. 샘플을 모두 팩안에 넣은 후에도 나머지 쪽도 100% blocking해서 상기처럼 누수가 일어나지 확인하고 탈염을 시작하시면 됩니다. 그런 다음에, 탈염하고자 하는 시료를 넣습니다. 이때 dialysis 팩의 길이를 너무 길게 하지 않도록 주의해야됩니다. 보통은 10cm 이하로 만드는 것이 좋습니다. 만약 샘플양이 많으면 dialysis 팩을 2-3개 준비해서 각각 잔여 샘플을 넣은 후에 탈염을 하시면 됩니다. 그런데 탈염 과정의 초기 동안에는 수조의 물을 시간의 구배에 따라 갈아줘야 됩니다. 예를 들어서, 샘플양이 많을 경우에는, 탈염시작부터 약 6시간 후에 수조의 물을 3차 증류수로 채워서 다시 갈아주고, 이후 12-15시간 정도에 한번 더 갈아주고, 24시간후에 한번, 마지막으로 34-36시간 사이에 한번 더 갈아준 후에 탈염을 진행해 보시기 바랍니다. 이렇듯 수조의 물을 갈아주지 않으면 dialysis 팩 안에 있던 염들이 수조밖으로 나와서 포화상태나 준포화상태가 되어서 결국 시간이 흐르면서 수조와 dialysis 팩 안과의 equilibrium이 일어나서 탈염 효과가 없어지게 되니 주의해야 됩니다. 3일간의 탈염이 끝난후에도 샘플을 회수하는 과정에서도 가능한 팩 안에 있는 샘플을 최대한 모두 회수해야 됩니다. 마치 1차 회수후에 3차 증류수로 팩안을 세척한 후에 그 세척액도 함께 모아서 동결건조를 해야 회수율이 높아지게 됩니다. Column chromatography를 사용해서 탈염을 하게 되더라도 샘플양은 감소하게 되어 있습니다. 비용과 효율성을 모두 고려한다면 dialysis 팩이 좋은 방법일 수 있습니다. 대안으로, 만약 실험실에 open glass column(가능하면 컬럼 길이를 15cm 정도로 사용)이 있다면, Sephadex G-15 계열의 레진으로 충진한 후에, 이동상을 3차 증류수를 사용해서 몇시간 이내에 탈염 효과를 볼 수도 있습니다. ㅅ 실험에 참고해 보세요. -
답변
안길홍님의 답변
2013-09-24- 0
참고 자료 첨부합니다. -
답변
김성훈님의 답변
2013-09-24- 0
dialysis를 하면 샘플의 유실이 많기 때문에 다음과 같은 방법을 해보시기 바랍니다. 1) 당의 구조를 알면 해당 당에 선택적인 lectin 컬럼 또는 레진을 사서 affinity로 결합한 후 salt를 제거하는 방법 2) GE에서 팔고 있는 desalting column (prepack)을 사서 elution 해 내는 방법 이 있습니다. 단백질이 아주 정제가 잘 됐다면 보통은 2)을 선택해서 10 mL desalting prepack column을 쓰면 2.5 mL로 desalting 된 샘플을 얻을 수 있습니다. 그후에 centricon으로 원하는 농도로 농축하면 원하시는 양의 단백질 샘플을 얻을 수 있을 겁니다. -
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이대훈님의 답변
2013-09-28- 0
감사합니다. 도움이 많이 될듯합니다..