2014-03-05
org.kosen.entty.User@74f8c69c
방지훈(haru9900)
- 2
안녕하세요. 물질분석을 위해 HPLC를 사용하고 있습니다.
계속 같은 조건으로 반복하여 문제없이 사용하고 있었는데 . 최근래에 몇가지 문제가 발생하였습니다.
사용하고 있는 조건은
HPLC aglient
- C18 컬럼 사용.
- 이동상 :1. 0.1M KH2PO4, 0.1M HCIO4 pH를 8N NaOH로 2.2 조정
2. ACN
( 1:2 =9:1) 각각 LC의 A,B 호스에 연결하여 분석하였습니다.
문제점 :
1. 삼일에 한번씩 매번 1번을 조제하여 사용하였는데요
분명 같은 방법으로 같은 사람이 만들었음에도 불구하고 최근에는 sonicate를 하고 난 뒤 석출되는 현상이 나타나며, 오래 보관하면서 관찰해보면 눈에 보일정도의 석출되는 물질이 생깁니다.
참고로 KH2PO4를 DW에 녹인후 0.1M HCIO4 을 첨가한뒤 NaOH로 pH를 조절합니다.
sonicate전에는 석출되는 물질이 없어요.
2. LC 컬럼 압이 매우 높습니다.
평상시 사용할때는 90~105 bar를 유지했는데요 지금은 160 bar 까지 올라갑니다.
LC를 여러명에서 사용하는 지라 앞 실험자가 쓴 이동상을 확인안하고 제가 사용할 컬럼을 바로 장착하여 용매의 혼합이 생겼을 수도 있지만 이게 이렇게 크게 영향을 미치나요 ?
3. 압력 탓인지 컬럼이 망가진 탓인지 peak가 전과 다르게 나타납니다.
기존의 peak입니다.
현재 나타나는 peak입니다. peak을 끌림?현상이 나타나고 있습니다.
peak 시간 대의 오차도 약 2분가량 나타나는데요.
1번이동상 pH에 따라 약간씩 차이는 나도 이렇게 까지는 난적이없습니다.
- 컬럼은 DW, 메탄올, 아세토나이트릴 순으로 몇차례 세척해보았습니다.
이런현상에 대해서 아시는분 답변 부탁드립니다. ㅠㅜ ^^
계속 같은 조건으로 반복하여 문제없이 사용하고 있었는데 . 최근래에 몇가지 문제가 발생하였습니다.
사용하고 있는 조건은
HPLC aglient
- C18 컬럼 사용.
- 이동상 :1. 0.1M KH2PO4, 0.1M HCIO4 pH를 8N NaOH로 2.2 조정
2. ACN
( 1:2 =9:1) 각각 LC의 A,B 호스에 연결하여 분석하였습니다.
문제점 :
1. 삼일에 한번씩 매번 1번을 조제하여 사용하였는데요
분명 같은 방법으로 같은 사람이 만들었음에도 불구하고 최근에는 sonicate를 하고 난 뒤 석출되는 현상이 나타나며, 오래 보관하면서 관찰해보면 눈에 보일정도의 석출되는 물질이 생깁니다.
참고로 KH2PO4를 DW에 녹인후 0.1M HCIO4 을 첨가한뒤 NaOH로 pH를 조절합니다.
sonicate전에는 석출되는 물질이 없어요.
2. LC 컬럼 압이 매우 높습니다.
평상시 사용할때는 90~105 bar를 유지했는데요 지금은 160 bar 까지 올라갑니다.
LC를 여러명에서 사용하는 지라 앞 실험자가 쓴 이동상을 확인안하고 제가 사용할 컬럼을 바로 장착하여 용매의 혼합이 생겼을 수도 있지만 이게 이렇게 크게 영향을 미치나요 ?
3. 압력 탓인지 컬럼이 망가진 탓인지 peak가 전과 다르게 나타납니다.
기존의 peak입니다.
현재 나타나는 peak입니다. peak을 끌림?현상이 나타나고 있습니다.
peak 시간 대의 오차도 약 2분가량 나타나는데요.
1번이동상 pH에 따라 약간씩 차이는 나도 이렇게 까지는 난적이없습니다.
- 컬럼은 DW, 메탄올, 아세토나이트릴 순으로 몇차례 세척해보았습니다.
이런현상에 대해서 아시는분 답변 부탁드립니다. ㅠㅜ ^^
- HPLC
- c18
- 이동상
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변 2
-
답변
조윤환님의 답변
2014-03-05- 0
반갑습니다. 질문 순서대로 답변 드리겠습니다.
1. 보통은 이동상 제조시 사용하는 시약에 변화가 있을 때 나타나는 현상입니다. 부적합한 시약을 사용한 것이 원인 입니다. 만약 사용하던 시약을 그대로 사용했는데도 이런 문제가 발생하고 있다면 물(DW)에 문제가 생긴 겁니다.
2. LC에서 압력 상승의 원인은 다양 합니다. 하지만 가장 흔한 원인은 컬럼이나 LC의 기타 다른 부분에 '막힘' 때문입니다. 검출기에서 주입부 방향으로 조인트를 하나씩 풀면서 압력 변화를 관찰하면 막힌 부분을 찾을 수 있습니다.
다른 사용자가 사용한 용매 때문에 압력이 크게 변화하는 경우는 두 가지 정도 입니다. 하나는 앞에서 사용한 사용자가 수용액과 섞이지 않는 유기용매를 이동상으로 사용한 경우(반대도 가능)이고, 두번째는 앞서 사용한 사용자가 완충액을 사용했는데 충분히 세척하지 않은 상태에서 유기용매(MeOH, ACN 등) 비중이 높은 이동상을 흘릴 경우 입니다.
보통은 두 번째 상황이 가능성이 높습니다. 이 경우에는 LC 내부 도관에 염이 석출되서 막힘이 발생하기 때문입니다.
3. 피크 형태의 변화는 컬럼과 가장 크게 관계되어 있습니다. 변화의 양상으로 볼 때 컬럼이 손상된 것으로 보입니다. 그리고 컬럼의 세척은 DW, MeOH, ACN 순으로 하시는 것은 바람직하지 않습니다. 완충액 때문에 DW로 먼저 세척한 것 같은데, 그렇게 하면 아마도 압력이 더 걸렸을 겁니다. 압력도 일정 수준 이상 상승하면 컬럼 손상의 원인이 됩니다.
보통 C18, C8 등의 역상 컬럼은 DW:ACN(또는 MeOH) = 50:50 정도로 세척 합니다. 그리고 컬럼의 세척방법은 컬럼 매뉴얼에 따라야 합니다. 컬럼마다 종류에 따라 세척 방법이 상이 합니다. 경우에 따라 오염의 정도가 심할 경우에는 rinsing 이라는 과정을 거치게 되는데, 이 또한 매뉴얼에 따라야 합니다.
피크의 형태나 RT가 변화했을 때는 손상이 주요원인이고, 그 다음은 펌프나 밸브 등에 문제가 생겼을 가능성이 큽니다.
도움이 되셨길........ -
답변
조윤환님의 답변
2014-03-06- 0
덧글로 주신 이동상 농도에 대한 답변입니다.
HPLC 완충용액 이동상의 농도는 10~100 mM 범위로 사용하는 것이 일반적입니다. 농도 범위를 벗어난 것은 아니기 때문에 잘못되었다고 할 수는 없지만 상위 한계 농도에 가깝고 일반적으로 사용하는 농도 범위가 25~50 mM인 점을 가만하면 높은 편입니다.
이동상의 농도는 sample size(mole)와 관계가 있습니다. 시료가 진한 용액이거나 주입량이 많은 경우, 즉 시료의 몰수가 크면 농도를 높여야 합니다. 완충용액 이동상은 pH를 일정하게 유지시켜서 시료의 이온 형태가 변하지 않도록 하는 역할을 합니다. 즉 시료의 양이 늘어나면 그 만큼 완충용액의 buffer capacity를 올려줘야 이 같은 역할을 제대로 수행할 수 있기 때문입니다.
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