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Oxybuprocaine 정량분석법좀 알려주세요

2014-03-31 org.kosen.entty.User@755be85d 김응배(dmdqo4150)
  • 2
안녕하세요. Oxybuprocaine(Benoxinate) 정량분석에 대해 문의드립니다.

기존 oxybuprocaine 분석에 대한 발표된 논문이 있는대요
(제목: Development and validation of a stability-indicating high performance liquid chromatographic assay for benoxinate)

논문상에는 phenyl 컬럼과 detector가 photodiode-array로 분석을 하였는데 C-18과 phenyl 컬럼은 큰 차이는 없다고 해서 저희가 가지고 있는 컬럼과 장비로 분석을 시도하려 하는데 피크가 보이질 않내요.
저희 분석조건으로
 - 컬럼 : c-18 (시세이도),
 - Flow rate : 1ml/min
 - Temp : 30도
 - Detector : UV (308nm)
 - mobile phase : ACN : DDW = 35(45) : 65(55)
 - Run time : 60min
 찍는 시료는 시그마에서 구매한 Benoxinate hydrochloride로 전처리 후(80도에서 20시간 인큐베이션) 1000ppm으로 분석하였습니다.

혹시 분석에 오류가 있었는지 도움좀 주세요~~

 
  • Oxybuprocaine
  • Benoxinate hydrochloride
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
  • 답변

    조윤환님의 답변

    2014-03-31
    • 3
    반갑습니다.

    Benoxinate의 HPLC분석에 대한 질문으로 피크 검출이 되지 않는 문제로 질문을 주셨군요.

    보통 C18과  C8 컬럼은 큰 차이가 없기 때문에 대체해서 사용하는 경우가 많습니다. 하지만 phenyl 컬럼과는 분리 성상이 좀 다릅니다.

    피크가 검출되지 않는 원인을 매우 다양하고, 실험자가 잘 인지하지 못한 실수가 원인인 경우가 많아서 질문만으로는 짐작하기 어렵습니다.

    분석에서 분리에 영향을 미치는 요인으로는 컬럼, 즉 고정상의 종류 외에도 많습니다. 이동상의 조성이나 유속, 분석온도 등이 같다고 해도 컬럼의 고정상 입자 크기, end-capping 여부, pore size, % carbon loading 등이 다르면 분리 성능이 달라 집니다.  

    언급하신 논문의 초록을 보니 10um 입자의 컬럼을 사용한 것으로 나타납니다. C18컬럼의 경우 보통 5um 입자를 사용합니다. 정확하기 일치하는 컬럼이 없어서 대체 컬럼을 사용한 경우라면 일반적인 입자크기인 5um 입자를 사용했을 가능성이 높겠습니다.

    그리고 질문자께서 사용하신 시세이도 C18컬럼은 모두 end-capped silica-based  컬럼이고 므로 non-endcapping silica based phenyl phase에 비해 고정상의 극성이 상대적으로 더 매우 낮기 때문에 컬럼 이외의 다른 분석조건을 동일했다고 한다면 피크의 RT가 크게 증가할 가능성이 높습니다. 즉 피크가 관찰되지 않은 것은 분석 시간이 너무 짧았기 때문일 가능성이 높습니다.

    참고하시길. 
    답변수정
    반갑습니다.

    Benoxinate의 HPLC분석에 대한 질문으로 피크 검출이 되지 않는 문제로 질문을 주셨군요.

    보통 C18과  C8 컬럼은 큰 차이가 없기 때문에 대체해서 사용하는 경우가 많습니다. 하지만 phenyl 컬럼과는 분리 성상이 좀 다릅니다.

    피크가 검출되지 않는 원인을 매우 다양하고, 실험자가 잘 인지하지 못한 실수가 원인인 경우가 많아서 질문만으로는 짐작하기 어렵습니다.

    분석에서 분리에 영향을 미치는 요인으로는 컬럼, 즉 고정상의 종류 외에도 많습니다. 이동상의 조성이나 유속, 분석온도 등이 같다고 해도 컬럼의 고정상 입자 크기, end-capping 여부, pore size, % carbon loading 등이 다르면 분리 성능이 달라 집니다.  

    언급하신 논문의 초록을 보니 10um 입자의 컬럼을 사용한 것으로 나타납니다. C18컬럼의 경우 보통 5um 입자를 사용합니다. 정확하기 일치하는 컬럼이 없어서 대체 컬럼을 사용한 경우라면 일반적인 입자크기인 5um 입자를 사용했을 가능성이 높겠습니다.

    그리고 질문자께서 사용하신 시세이도 C18컬럼은 모두 end-capped silica-based  컬럼이고 므로 non-endcapping silica based phenyl phase에 비해 고정상의 극성이 상대적으로 더 매우 낮기 때문에 컬럼 이외의 다른 분석조건을 동일했다고 한다면 피크의 RT가 크게 증가할 가능성이 높습니다. 즉 피크가 관찰되지 않은 것은 분석 시간이 너무 짧았기 때문일 가능성이 높습니다.

    참고하시길. 
    김응배(dmdqo4150) 2014-04-20

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    김응배(dmdqo4150) 2014-04-20

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  • 답변

    조윤환님의 답변

    2014-04-01
    • 0
    실험에 도움이 되셨다니 다행입니다.

    현재 피크가 매우 넓게 나오는 것에 대해서는 단정적으로 말씀드리기 어렵습니다.

    그 동안 피크가 관찰되지 않았기 때문에 여러차례 반복해서 실험을 실시했을 겁니다. 150분 정도에 피크가 관찰된다면 그동안 한 실험에서 주입된 시료가 거의 고스란히 컬럼안에 축적되었을 가능성이 높고 ACN의 농도를 높이자 그 것들이 한께번에 나오고 있는 것으로 판단됩니다.

    얼마나 반복해서 실험을 하셨는지 알 수 없으나, 축적된 시료가 컬럼이 감당하기 어려운 정도의 양이기 때문에 넓게 퍼져서 나오는 것으로 추측 됩니다.

    지금 현재 피크가 관찰된다고 해도 온전한 모습일 가능성이 낮습니다. 따라서 컬럼에 대한 크리닝을 실시하신 후에 새로 실험을 해보길 권합니다.

    더불어 한 가지 유념하셔야할 부분은 Benoxinate 자체가 소수성이 강한 아민계 화합물이라는 점입니다. RP 컬럼으로 분석할 때 아민계 화합물처럼 극성이 강한 화합물은 tailing 현상이 일어나기 쉽습니다. 이 때문에 피크가 넓게 퍼져 나오기도 한다는 점입니다.

    그리고 알려진 분석조건을 이용하더라도 그 분석조건이 자신의 상황에 맞는지 생각해볼 필요가 있습니다. 질문에서 언급하신 논문은 Benoxinate을 인위적으로 분해되기 쉬운 환경에 노출 시킨 다음 생성되는 분해생성물들을 분석하기 위한 분석조건입니다.

    따라서 단순히 표적 성분만을 정량하는 것이라면 위 분석조건을 꼭 사용할 필요는 없다는 겁니다. 참고 논문에서 사용한 것과 동일한 컬럼이 없는 상황이라면 더욱 그렇습니다.오히려 현재 보유하고 있는 컬럼을 활용할 수 있는 분석조건을 찾아 보시는 것이 좋겠습니다.


     
     
    답변수정
    실험에 도움이 되셨다니 다행입니다.

    현재 피크가 매우 넓게 나오는 것에 대해서는 단정적으로 말씀드리기 어렵습니다.

    그 동안 피크가 관찰되지 않았기 때문에 여러차례 반복해서 실험을 실시했을 겁니다. 150분 정도에 피크가 관찰된다면 그동안 한 실험에서 주입된 시료가 거의 고스란히 컬럼안에 축적되었을 가능성이 높고 ACN의 농도를 높이자 그 것들이 한께번에 나오고 있는 것으로 판단됩니다.

    얼마나 반복해서 실험을 하셨는지 알 수 없으나, 축적된 시료가 컬럼이 감당하기 어려운 정도의 양이기 때문에 넓게 퍼져서 나오는 것으로 추측 됩니다.

    지금 현재 피크가 관찰된다고 해도 온전한 모습일 가능성이 낮습니다. 따라서 컬럼에 대한 크리닝을 실시하신 후에 새로 실험을 해보길 권합니다.

    더불어 한 가지 유념하셔야할 부분은 Benoxinate 자체가 소수성이 강한 아민계 화합물이라는 점입니다. RP 컬럼으로 분석할 때 아민계 화합물처럼 극성이 강한 화합물은 tailing 현상이 일어나기 쉽습니다. 이 때문에 피크가 넓게 퍼져 나오기도 한다는 점입니다.

    그리고 알려진 분석조건을 이용하더라도 그 분석조건이 자신의 상황에 맞는지 생각해볼 필요가 있습니다. 질문에서 언급하신 논문은 Benoxinate을 인위적으로 분해되기 쉬운 환경에 노출 시킨 다음 생성되는 분해생성물들을 분석하기 위한 분석조건입니다.

    따라서 단순히 표적 성분만을 정량하는 것이라면 위 분석조건을 꼭 사용할 필요는 없다는 겁니다. 참고 논문에서 사용한 것과 동일한 컬럼이 없는 상황이라면 더욱 그렇습니다.오히려 현재 보유하고 있는 컬럼을 활용할 수 있는 분석조건을 찾아 보시는 것이 좋겠습니다.


     
     
    김응배(dmdqo4150) 2014-04-20

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