2014-04-02
org.kosen.entty.User@2de33dd4
김승우(nokjun)
- 2
안녕하십니까
생화학이나 효소에 관해서는 비 전공자이지만, 이번에 학위 논문을 쓰게 되면서 실험을 하게된
대학원생 입니다. 다름이 아니라 단백질을 분해하는 효소 활성을 측정하기 위해 실험을 하고 있습니다. 참고논문에서의 방법을 보자면 아래와 같습니다. 실제로 이 방법으로 흡광도도 측정했습니다. 그런데 컨트롤의 흡광도는 0.000이 나오고 제가 측정한 시료는 0.106이 나왔습니다. 이걸 어떻게 해야 unit이라던가 효소활성단위로 나타낼지 궁금합니다. 아래와 같은 방법이 아니라면 (본 반응의 흡광도 X 공시험의 흡광도)X희석배수 라고도 하던데... 뭐가 뭔지 모르겠습니다. 도와주세요!!!
각각의 시료들 1g에 20mL의 증류수를 넣고 shaking incubater에
서 37℃,140rpm의 조건으로 30분간 추출한 뒤 cheesecloth로 여과하고 여과액을
5500rpm,4℃에서 20분간 원심 분리한 후 상등액을 분리하여 조효소액으로 사용하
였으며 각각의 조효소액 1mL를 시험관에 취하고 pH를 7로 조정한 0.6% casein용
액 5mL를 가하여 잘 흔들고 10분간 37℃ 항온수조에서 반응시킨 후 0.44M
Trichoroaceticacid(TCA)5mL를 넣어 반응을 중지시키고 항온수조 내에 약 30분
간 방치시켰다. 침전이 완료되면 와트만 여과지(#40)로 여과하여 여액 1mL를
0.55M Na2CO3용액 5mL와 Folin 시약 1mL를 넣어서 흔든 후 30℃에서 30분간 방
치시키고 660nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 Tyrosine함량을 나타내는 표준곡
선(y=1.5719x+0.0205,r2=0.9957)과 비교하여 측정하였다.
생화학이나 효소에 관해서는 비 전공자이지만, 이번에 학위 논문을 쓰게 되면서 실험을 하게된
대학원생 입니다. 다름이 아니라 단백질을 분해하는 효소 활성을 측정하기 위해 실험을 하고 있습니다. 참고논문에서의 방법을 보자면 아래와 같습니다. 실제로 이 방법으로 흡광도도 측정했습니다. 그런데 컨트롤의 흡광도는 0.000이 나오고 제가 측정한 시료는 0.106이 나왔습니다. 이걸 어떻게 해야 unit이라던가 효소활성단위로 나타낼지 궁금합니다. 아래와 같은 방법이 아니라면 (본 반응의 흡광도 X 공시험의 흡광도)X희석배수 라고도 하던데... 뭐가 뭔지 모르겠습니다. 도와주세요!!!
각각의 시료들 1g에 20mL의 증류수를 넣고 shaking incubater에
서 37℃,140rpm의 조건으로 30분간 추출한 뒤 cheesecloth로 여과하고 여과액을
5500rpm,4℃에서 20분간 원심 분리한 후 상등액을 분리하여 조효소액으로 사용하
였으며 각각의 조효소액 1mL를 시험관에 취하고 pH를 7로 조정한 0.6% casein용
액 5mL를 가하여 잘 흔들고 10분간 37℃ 항온수조에서 반응시킨 후 0.44M
Trichoroaceticacid(TCA)5mL를 넣어 반응을 중지시키고 항온수조 내에 약 30분
간 방치시켰다. 침전이 완료되면 와트만 여과지(#40)로 여과하여 여액 1mL를
0.55M Na2CO3용액 5mL와 Folin 시약 1mL를 넣어서 흔든 후 30℃에서 30분간 방
치시키고 660nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 Tyrosine함량을 나타내는 표준곡
선(y=1.5719x+0.0205,r2=0.9957)과 비교하여 측정하였다.
- 효소활성
- 단백질 분해
- 효소학
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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답변
이호진님의 답변
2014-04-18- 0
적어 놓으신 것만 가지고는 단위를 예측하기가 어려워 보입니다.
파장 660 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 값을 식에 넣으면 0.187 이라는 숫자가 나오는데, y의 단위가 뭐냐가 알 수가 없다는 것이지요?
웹사이트에 찾아봤더니, 660 nm를 이용한 에세이 방법이 상업용으로 나와 있더라구요.
http://www.piercenet.com/product/660-nm-protein-assay
아마도 사용하신 방법이 이것이 아닌가 싶네요.
660nm는 tyrosin이 흡수를 강하게 하는 파장이 아니여서 이상해서 찾아봤는데, 특수한 물질을 사용하는 것 같습니다. 이것과 관련이 있다면, 단백질의 양은 ug/ml이 되네요.
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답변
성학모님의 답변
2014-04-22- 0
알고자 하는 물질의 효소적 활성, 농도 등을 알고싶을 때 검증되었거나 상용화된 표준제품을 사용합니다.
질문자의 내용에서 Tyrosine함량을 나타내는 표준곡선(y=1.5719x+0.0205,r2=0.9957)을 활용하면 표준곡선 식에 측정한 흡광도를 입력하면 검체의 농도를 알수 있겠네요.
이를 활성도로 나타내고자 한다면 해당 효소의 활성정의를 참고해야합니다.
일반적으로 1 Unit라고 하면 효소 1ug이 기질 1mg을 1분에 분해하는 양 또는 분해시간을 말합니다.
예를 들어 혈액단백질인 트롬빈의 역가는 피브리노겐 단백질을 1분에 응고되는 시간을 1 Unit로 하고 있습니다.