2014-04-24
org.kosen.entty.User@5a8d244e
김자민(jamine789)
- 2
안녕하세요.
다름이 아니라
Enzyme을 E.coli에서 발현하려고 합니다.
그래서 gene을 합성하려고 하는데,
제가 원하는 enzyme이 3개의 gene으로 구성되어있는데요.
이것을 어떻게 유전자를 합성해야할지 여쭤보려고 합니다.
그냥 3개의 gene을 하나로 합성해도 될까요?
답변 부탁드리겠습니다.
기존의 enzyme은 주로 해당균주로부터 직접 뽑아서 사용한다고 합니다.
하지만 저는 대량으로 필요해서, E.coli에 발현을 원합니다.
다름이 아니라
Enzyme을 E.coli에서 발현하려고 합니다.
그래서 gene을 합성하려고 하는데,
제가 원하는 enzyme이 3개의 gene으로 구성되어있는데요.
이것을 어떻게 유전자를 합성해야할지 여쭤보려고 합니다.
그냥 3개의 gene을 하나로 합성해도 될까요?
답변 부탁드리겠습니다.
기존의 enzyme은 주로 해당균주로부터 직접 뽑아서 사용한다고 합니다.
하지만 저는 대량으로 필요해서, E.coli에 발현을 원합니다.
- expression
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답변 2
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답변
황규찬님의 답변
2014-04-25- 0
일반적으로 포유세포에서는 여러 유전자들을 하나의 강력한 프로모터에서 아래와 같은 방법에 의해 발현을 유도합니다.
1) 여러 유전자들을 마지막 유전자의 stop codon만 남기고 중간에 들어가는 유전자의 stop codon위치에 self cleavage peptide (2A)를 in frame에 맞추어 넣습니다. 그러면 하나의 transcript (mRNA)에 번역(translation, protein 합성)후 하나의 단백질이 넣어준 여러 유전자에 따라 여러개의 단백질로 잘리게 됩니다. 단점은 C-말단에 약간의 Taq(peptides)이 붙는다는 것임. 그래서 그것이 그 enzyme의 기능에 영향을 미치는지 알아보기 디자인해야 합니다.
2) 여러 유전자 사이에 각각의 독립적인 IRES 프로모터를 넣어주면, 하나의 벡터에서 여러개의 유전자가 독립적으로 발현을 할 수 있습니다. 단점은 동일하게 발현이 되지 않을 수 있다는 것임.
위에서 열거한 방법들이 E. coli에서도 적용할 수 있는지 혹은 대체할 수 있는 시스템이 있는지 알아보시면 좋을 것 같네요. -
답변
이호진님의 답변
2014-04-30- 0
1. 연구하고자 하는 효소를 찾습니다.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi
예) PKC
PKC에 대한 Gene Link를 클릭합니다. (Human)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/112476
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi?REQUEST=CCDS&DATA=CCDS58445.1
CCDS sequence Data에 보시면 DNA와 protein sequence가 나옵니다.
커서를 움직이면, 어떤 DNA가 어떤 아미노산에 해당하고 위치가 어디인지 알 수 있습니다.
원하는 부분의 DNA를 copy합니다.
이것을 E. coli에서 대량 생산하려면,
Bad Codon을 확인해야 합니다.
http://www.faculty.ucr.edu/~mmaduro/codonusage/usage.htm
DNA 시퀀스가 사람에서는 발현되지만, 대장균은 싫어할 수 있습니다. 그래서 하는 것이지요.
그러면 어떤 codon을 바꾸라는 제안이 나옵니다.
프로그램에서 하라는대로 하면, 완벽할 것 같은데,
모두 따라서 하면 효소가 발현이 되지 않을 수도 있습니다.
codon은 400개까지는 합성이 된다고 알고 있습니다.
그 다음에 어떤 벡터를 써야 할지는 고민을 좀 해 보셔서 합니다.
도움이 되시길 바랍니다.