2014-06-12
org.kosen.entty.User@366f4cd1
최원지(choiwjeh1)
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b-catenin 을 총 4개의 Domain ( 1~140 , 141~390 , 391~663 , 664~ 782) 으로 나누어 cloning 을 하고 있는 석사 과정 학생입니다.
KIT ( i-Taq DNA polymerase , dNTPs , Reaction Buffer(10X) , Gel loading buffer) 를 써서 진행 중인데요.
PROTOCOL 에는 Plasmid DNA : 10pg~100ng
PRIMER F,R : 5-20pmol/ul 가 적합하다고 해서 이 범위안에서 하고있습니다.
제가 제작한 PRIMER 의 Tm 값은 70도로 유지를 해놓았구요.
PCR을 하고 나서 확인하면 PRODUCT의 SIZE가 맞지가 않습니다.....
부탁드립니다!!!! 도와주세요ㅠㅠ
KIT ( i-Taq DNA polymerase , dNTPs , Reaction Buffer(10X) , Gel loading buffer) 를 써서 진행 중인데요.
PROTOCOL 에는 Plasmid DNA : 10pg~100ng
PRIMER F,R : 5-20pmol/ul 가 적합하다고 해서 이 범위안에서 하고있습니다.
제가 제작한 PRIMER 의 Tm 값은 70도로 유지를 해놓았구요.
PCR을 하고 나서 확인하면 PRODUCT의 SIZE가 맞지가 않습니다.....
부탁드립니다!!!! 도와주세요ㅠㅠ
- PCR
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답변 3
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답변
황규찬님의 답변
2014-06-16- 0
~b-catenin의 domain별 subcloning을 할 경우 각각의 primer들이 약간의 유사성이 있다면 여러위치에 결합하여 다양한 PCR product들이 생길 수 있습니다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 아래와 같이 해 보세요.
1) primer간에 유사성이 거의 없도록 디자인하세요.
2) 반드시 정해진 부위만을 subcloning하고자 한다면 다시 nested PCR를 통해 원하는 band를 찾으세요.
3) 그것도 어렵다면 Restriction enzme으로 원하는 부위는 잘리지 않고 다른 부위들이 잘린 plasmid를 template로 PCR 해보세요.
4) 그래도 해결이 되지 않으면, Bioneer 같은 업체에서 해당하는 부위를 합성하면 됩니다. 요즘은 저렴하게 합성 가능합니다. -
답변
이보람님의 답변
2014-06-16- 0
정확한 타켓 밴드를 잡아내기 위해서는 우선 프라이머의 특이성이 매우 중요합니다.
프라이머를 제작할때 질을 향상시키기 위해 HPLC나 PAGE 정제를 추천드리며,
프라이머의 길이를 늘리는 방법도 원하는 부분을 특이적으로 증폭하기 위한 방법입니다.
그리고 Pfu Taq. Polymerase를 추천드립니다.
감사합니다.
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답변
김성훈님의 답변
2014-06-16- 0
제생각엔 template로 쓰는 vector를 시퀀싱을 통해 다시 한번 확인하고
프라이머 시퀀스상에 중복되는 부분이 없는지를 확인 하는게 좋을 것 같다고 생각합니다.
PCR은 robostic한 반응이라
우리가 알고 있는 원칙이 거의 맞죠. 그런데..이런 원칙을 벗어나는 경우가
template에 repeated seq.나 primer set에 유사한 서열 때문에 생기기도 합니다.