2014-06-12
org.kosen.entty.User@3701f893
김주혁(kjh5703)
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현재 위의 박테리아를 LB배지에서 37도의 조건에서 키워
gDNA를 prep하고 있습니다만 잘 안됩니다.
현재 Qiagen제품을 쓰고있는데 특별히 주의할 사항같은점이 있습니까?
Lysis자체가 잘 안되는 느낌입니다.
gDNA를 prep하고 있습니다만 잘 안됩니다.
현재 Qiagen제품을 쓰고있는데 특별히 주의할 사항같은점이 있습니까?
Lysis자체가 잘 안되는 느낌입니다.
- genomic dna
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답변 3
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답변
이상후님의 답변
2014-06-16- 0
Streptococcus pyogenes를 포함하여 E.coli나 B. subtilis 같은 미생물의 배양액에서 gDNA를 분리하기 위해서는 단순히 Qiagen kit을 사용하는 것 보다는 특정 lysis buffer와 함께 사용하는 것이 추출에 효과적입니다.
효과적인 추출을 위해서는 mechanical lysis로서 pathogen lysis tube (S 또는 L)와 TissueLyser LT를 병행 사용하고, QIAamp UCP pathogen kit를 사용하시면 됩니다.
이런 복합적인 사용에 대한 효과적인 결과를 첨부파일로 업로드 하니 참고하시기 바랍니다. -
답변
김성훈님의 답변
2014-06-16- 0
genomic DNA prep에 있어 성패의 결정은 최초단계인 cell lysis 에 있습니다.
S.pyogenes의 경우는 gram positive 이기 때문에 cell lysis가 잘 안될 가능성이 있죠.
그리고 세포를 어떤 배지에 어떻게 키우고, 언제 harvest 하느냐도 cell wall의 두께를 결정하기 때문에 세포의 lysis에 영향을 줍니다.
결론적으로
Brain heart infusion (BHI) broth와 같은 rich medium에서 mid-exponential phase 까지 키우다가
harvest를 하고 여기에 과량의 lysozyme을 충분한 시간 (5-6시간 또는 o/n)처리해서
다시 세포를 회수를 한후, 여기에 일반적인 kit에 있는 lysis buffer를 써서 55C-60C에서
반응을 시켜 보면 세포가 완전히 lysis가 되서 용액이 맑게 변하면 DNA를 뽑는데 무리가 없을
겁니다.
박테리아뿐 아니라 모든 종에서 DNA 뽑는 것도 마찬가지 입니다.
세포 lysis를 어떻게 하느냐가 관건이죠. 참고하시길....
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답변
김상태님의 답변
2014-12-26- 0
양성균이므로 표면 배당체나 표면항원이 맣아서 이를 제거하는데 LYSOZYME으로 녹인후 LYSIS BUFFER으로 추출하면 되는데 그람포지티브균은 주롷 물리적인 열을 가해서 gDNA추출하는 것이 나음