2014-06-27
org.kosen.entty.User@3b8aef03
김주혁(kjh5703)
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님들 promega의 A1360 pGEM T easy vector를 아시나요?
전 현재 이 3kb짜리 vector에 7.5kb 정도의 Insert를 넣는 cloning을 하고 있습니다.
문제는 이전에 비슷한 크기의 Insert가 한번에 들어갔는데 도저히 들어가지 않는다는 점입니다.
현재 Tetracycline, Kanamycin 2개의 marker가 각자 있는 2개의 7.5kb Insert를 넣고 있는데
이전에는 Insert:vector의 ng비율이 3:1으로 해도 잘 되었는데 시험삼아 1:1,1:2,3:1 다 해봐도 안됩니다.
plate에 문제가 없다는것은 확인했고요. cloning관련 잘 아시는 분은 도움주시면 감사하겠습니다.
전 현재 이 3kb짜리 vector에 7.5kb 정도의 Insert를 넣는 cloning을 하고 있습니다.
문제는 이전에 비슷한 크기의 Insert가 한번에 들어갔는데 도저히 들어가지 않는다는 점입니다.
현재 Tetracycline, Kanamycin 2개의 marker가 각자 있는 2개의 7.5kb Insert를 넣고 있는데
이전에는 Insert:vector의 ng비율이 3:1으로 해도 잘 되었는데 시험삼아 1:1,1:2,3:1 다 해봐도 안됩니다.
plate에 문제가 없다는것은 확인했고요. cloning관련 잘 아시는 분은 도움주시면 감사하겠습니다.
- DNA
- cloning
- ligation
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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답변
배소현님의 답변
2014-06-27- 1
아예 colony가 안 생기나요? 아님, colony는 생기는데 insert가 안 들어있는 건가요?
만일 colony가 아예 안 생긴다면 지금 insert가 훨씬 size가 크니까 오히려 vector의 비율을 늘려야 하지 않을까 싶기도 하고...
사용하시는 lligase가 어떤 종류인지도 궁금합니다.
저희 실험실에서는 T4 ligase로 cloning이 잘 안 되는 경우 Clontech의 In-Fusion enzyme을 사용하면 훨씬 잘 되더군요. 물론 경우에 따라 다르긴 하겠지만요... -
답변
황규찬님의 답변
2014-06-30- 0
전체 사이즈가 10kb되면 chemical competent cell보다는 electroporation으로 해 보세요.