2014-09-05
org.kosen.entty.User@3b7853d2
김주혁(kjh5703)
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저는 현재 특정 균주 내의 Homologous recombination을 이용해
특정 유전자에 marker를 삽입해 deletion하는 일을 하고 있습니다.
그런데 보시다시피 위 왼쪽 그림의 빨간 원 안의 DNA가 원래 DNA가 사라지고
marker가 삽입되서 바뀐, 제가 원하는 3kb size의 band인데 오른쪽 그림에서
보시다시피 band가 4kb 정도로 1kb 가량 커졌습니다. 원인이 뭘까요??
- DNA
- PCR
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답변 4
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답변
심용호님의 답변
2014-09-11- 1
답변에 앞서서, 내용을 정확히 알아야 뭔가 추측하거나 예상할 수 있다는 말을 드리고 싶습니다.
아무런 정보가 없는 상태에서 정확한 원인을 알 수 없지만, 하시는 일이 마커를 삽입하는 단계라면 (어떤 마커? 분자량 등 정보 필요) 마커가 기대하는것 보다 더 많이 붙은거겠죠.
그게 아니라면 분석과정에서의 오염? 기타 등등을 먼저 점검할 필요가 있습니다.
도저히, 마커도 아니고 작업과정에서의 혼돈이 아니라면.. 저라면 처음부터 차근차근 다시 해보겠습니다. 힘들어도 이런 결과가 나올 때는 확인을 하고 넘어갈 필요가 있습니다.
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답변
황규찬님의 답변
2014-09-11- 1
특정 유전자가 KO된 균주를 선발하기 위해 neoR 혹은 형광유전자와 같은 외래유전자가 HR에 의해 형질전환되었는지 여부를 확인하기 위해 genome PCR 방법을 활용하였지만 예상했던 3kb보다 1kb가 많은 4kb가 band상에서 확인되었기 때문에 헷갈리것 같습니다.
그렇다면 제대로 예상했던 대로 HR에 의해 genome상에 삽입되었는지를 확인해야 합니다. 여러 가능성이 있습니다. 우선 4kb를 subcloning하신후 읽어 보시면 답이 나옵니다. 그다음 해결책을 다시 설계하시면 좋을것 같네요. -
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김상태님의 답변
2014-10-14- 1
아마도 self ligation이거나 delation상태가 아닌 원래상태이거나 그렇죠
가장 좋은 것은 양쪽을 오려서 prep.후 유전자 염기서열을 분석하는 것이 ㄷ가장 확립적일것입니다 그래서 가장 그 차이가 뭔지 alignment해보면 답이 나오겠죠 -
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김상태님의 답변
2014-11-10- 1
아마도 마커가 다이머로 연결되었거나 셀프 절단으로 다른 절편들끼리 연결되어 밴드가 shift된것일 사료됨
그밴드를 올려서 sequencing하면 어떤식을 배열한것을 알면 백본에서 상호 alignment하여 다른이유를 신속히 알수 있음 아님
이것으로 오랫동안 헤매게 될수도 잇음