2014-12-01
org.kosen.entty.User@695511db
장은지(eungi2da)
- 10
첨부파일
안녕하세요~
최근 세포를 96well plate에 cell seeding한후, 약물처리하고 72hr incubation해서 세포독성을 보고있는데요, 이전까지 똑같은 cell에서 실험할 때는 아무문제 없었는데 최근들어 MTT처리한 후에 formazan형성될 때 보라색이 well의 벽면쪽에 뭉쳐서 나타납니다.
보니까 cell은 아닌것 같았구요, 그래서 MTT시료에 문제가 있나싶어서 확인해봤더니 약간 가루들이 묻어있더라구요. 잘안녹았나싶어서 water bath에 넣고 vortexing해서 녹이고 다시 실험해봤는데 역시나 보라색물질이 벽면에 뭉쳐서 붙어있기도 하고 cell viability도 이때문에 높아진것 같습니다.
그런데 원인을 잘모르겠어서 세포가 이상한건지 ㅠ 아직 초보라 어디서 제가 실수를 한건지 생각해봐도 답이 나오지 않습니다. 혹시 아신다면 답변부탁드립니다~
* 사진첨부하였습니다.
최근 세포를 96well plate에 cell seeding한후, 약물처리하고 72hr incubation해서 세포독성을 보고있는데요, 이전까지 똑같은 cell에서 실험할 때는 아무문제 없었는데 최근들어 MTT처리한 후에 formazan형성될 때 보라색이 well의 벽면쪽에 뭉쳐서 나타납니다.
보니까 cell은 아닌것 같았구요, 그래서 MTT시료에 문제가 있나싶어서 확인해봤더니 약간 가루들이 묻어있더라구요. 잘안녹았나싶어서 water bath에 넣고 vortexing해서 녹이고 다시 실험해봤는데 역시나 보라색물질이 벽면에 뭉쳐서 붙어있기도 하고 cell viability도 이때문에 높아진것 같습니다.
그런데 원인을 잘모르겠어서 세포가 이상한건지 ㅠ 아직 초보라 어디서 제가 실수를 한건지 생각해봐도 답이 나오지 않습니다. 혹시 아신다면 답변부탁드립니다~
* 사진첨부하였습니다.
- MTT
지식의 출발은 질문, 모든 지식의 완성은 답변!
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변 10
-
답변
김상태님의 답변
2014-12-07- 2
아마도 세균의 오염이나 곰팡이의 오염을 고려할 필요가 잇음 -
답변
김성훈님의 답변
2014-12-02- 1
MTT 농도를 얼마로 해서 쓰시는지 모르겠는데
solubility 문제 아닌가 합니다.
"MTT is soluble in water (10 mg/ml), ethanol (20 mg/ml) and is also soluble in buffered salt
solutions and culture media (5 mg/ml)"
이라고 구글링을 하면 쉽게 찾을 수 있죠.
여기 보시면 ..순순한 물에는 10 mg/ml 그리고 다양한 compound가 있는 culture medium
같은데는 이의 절반인 5 mg/ml만 녹게 되어 있습니다,
쓰시는 stock solution을 체크해보시는게 좋을 것 같네요.
도움되셨길
-
답변
이배훈님의 답변
2014-12-02- 1
MTT는 독성 문제도 있고, solubility 문제가 있어
요즘은 WST (water soluble tetrazolium)이 독성도 많지 않고, 물에 녹아
세포독성 및 세포 수를 관찰하는데 많이 이용됩니다.
-
답변
김상태님의 답변
2014-12-02- 1
mtt처리전과정을 알려주시고 세포사진도 알려주시고 얼마나 시간이 지나서 적자색이 벽에 붙는지 알려주세요
-
답변
김병모님의 답변
2014-12-03- 1
MTT로부터 만들어진 Formazan은 PBS나 DDW에 잘 녹지 않습니다.
대신 Isopropanol에 잘 녹습니다.
-
답변
김상태님의 답변
2014-12-07- 1
원래 mtt시약은 노란색의 투명한 색인데 증류수나 에탄올에 녹이지만 잘못 만들경우 입자가 생기고
이 시약은 원래 살아있는 세포내의 미토콘드리아의 숙신산 디하이드로게나제가 존재시 이 염료가 환우너형으로 되면서 적자색을 띠어 생존률을 확인하는 방법인데 잘 하지 않고 상기의 문제가 발생시 처음부터 꼼꼼히 시약 조재부터 처리후 세포에만 존재하는지 현미경으로 관찰하면서 메탄올이나 dmso로 고정후 살아 있을때 세포의 상태와 비교시 잘 부착된 상태인지 확인도 하고 mtt처리후의 세포내에서 mtt가 적자색으로 변하는지 아님 세포밖이나 벽에 존재하면 세포의 분리나 다른 생명체에 의해 (예; 세균, 곰팡이) 염색전환이 될수 있을 가능성도 배제하지 못함 -
답변
김상태님의 답변
2014-12-16- 1
mtt는 산화형으로 되어 있어 용해를 하기 위해 rmrtjddls MeOH, isopropanol, dmso으로 녹여서 튜브나 cornical tube에 미리 분배해서 냉동고에 보관하다가 사용시 녹여서 사용해야 오랫동안 상용이 가능함 -
답변
김제현님의 답변
2015-02-14- 1
MTT 용액을 만드신 후에 침전을 제거 후 사용하길 권하고
보라색이 well에 생기는 것은 있을 수 있는 일입니다.
DMSO로 처리 후 측정해 보십시요.
그리고 요즘에는 XTT 많이 사용하니 확인해 보시길 바랍니다. -
답변
이규식님의 답변
2015-03-17- 1
우선 96-well plate의 기벽에 붙어 있다는 것이 문제인것이네요. 이는 실험에 사용한 시료가 플라스틱 소재에 대한 흡착력이 강하면 나타날 수 있겠죠. 초기에 시료의 stock solution을 무엇으로 만들었는지도 검증이 필요할 것 같습니다. 이는 유기용매에는 녹아 있으나 실험에서는 배지에 첨가하게 되는데 배지의 경우 잘 아시겠지만 water가 대부분입니다. 따라서 비극성 물질의 경우 배지에 첨가하는 경우 침전이 생기는 경우는 충분히 있습니다. 시료를 준비할 때 serial dilution을 한 후에 반드시 침전물이 생기는지 여부를 확인하고 실험을 시작해야되겠죠. 눈으로 침전의 여부가 불명확하다면 serial dilution한 conditioned solution을 blank로 하여 같이 incubation을 하고 MTT 전과정을 같이 해보세요. Blank에도 기벽에 그러한 침전이 생긴다면 그것은 분명 용해도에 따른 문제라는 것이 분명해질 것입니다. 참고로, polyphenolic compound의 경우 MTT나 MTS 모두에서 흡광도에 영향을 미치기 때문에 확실한 효과를 검증하는데 한계가 있습니다. 따라사 MTT를 하기전에 세포 상태를 확인하시고 가능하다면 사진을 찍어서 보관하고 선배 혹은 보스에게 보여주고 이야기해서 보다 적절한 실험방법을 찾을 수 있도록 할 것을 권합니다. -
답변
이규식님의 답변
2015-03-17- 1
우선 96-well plate의 기벽에 붙어 있다는 것이 문제인것이네요. 이는 실험에 사용한 시료가 플라스틱 소재에 대한 흡착력이 강하면 나타날 수 있겠죠. 초기에 시료의 stock solution을 무엇으로 만들었는지도 검증이 필요할 것 같습니다. 이는 유기용매에는 녹아 있으나 실험에서는 배지에 첨가하게 되는데 배지의 경우 잘 아시겠지만 water가 대부분입니다. 따라서 비극성 물질의 경우 배지에 첨가하는 경우 침전이 생기는 경우는 충분히 있습니다. 시료를 준비할 때 serial dilution을 한 후에 반드시 침전물이 생기는지 여부를 확인하고 실험을 시작해야되겠죠. 눈으로 침전의 여부가 불명확하다면 serial dilution한 conditioned solution을 blank로 하여 같이 incubation을 하고 MTT 전과정을 같이 해보세요. Blank에도 기벽에 그러한 침전이 생긴다면 그것은 분명 용해도에 따른 문제라는 것이 분명해질 것입니다. 참고로, polyphenolic compound의 경우 MTT나 MTS 모두에서 흡광도에 영향을 미치기 때문에 확실한 효과를 검증하는데 한계가 있습니다. 따라사 MTT를 하기전에 세포 상태를 확인하시고 가능하다면 사진을 찍어서 보관하고 선배 혹은 보스에게 보여주고 이야기해서 보다 적절한 실험방법을 찾을 수 있도록 할 것을 권합니다.