2015-07-02
org.kosen.entty.User@27556e5d
이성일(lsi0153)
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서던블랏중인 학생입니다. Roche사의 Biotin-hign prime을 사용하여 probe labeling해서 사용하고 있습니다. 프로브 레이블링은 dot으로 확인해서 이상이 없는데 membrane transfer와 hybridization후에는 컨트롤로 찍은 프로브만 디텍션 되고 나머지는 디텍션이 되지 않습니다. 사용한 DNA는 2ug을 사용하였고요... gDNA를 너무 적게 사용한 건가요..? 다른 질문은 DIG와 Biotin labeling의 감도 차이가 많이 나는지 알고 싶습니다.
- southern
- biotin
- DIG
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답변 2
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답변
황규찬님의 답변
2015-07-03- 1
원하는 결과를 얻기 위해서 체크해야 할 사항들
1) gDNA를 제한효소를 절단하였을 때 완전히 제한되었는지를 확인
- 순도/농도가 모두 높은 gDNA를 얻고 높은 Unit의 제한효소 선택
- 일반적이 제한효소 선택
- 완전히 digestion되어야 signal이 한곳으로 모이기 때문에 매우 중요
- gDNA 양을 높일 필요 (30ug 전후)
2) Membrane tranfer가 잘 되었는지 확인
- 대부분 membrane tranfer가 되었는지 gel를 staining하여 확인
- 적합한 membrane를 사용하는지 혹은 UV 혹은 baking으로 고정할 필요는 없는지 확인
3) 프로브는 적당한 size로 만들었는지 혹은 reaction는 잘 되었는지 확인
4) washing buffer 조성, 시간, 온도, 횟수는 적당한지 확인
등등 확인할 필요가 있습니다. 서던은 쉽지 않으나 조건을 잡으면 그 다음부터는 쉽습니다.
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답변
김제현님의 답변
2015-07-11- 1
2 가지가 생각나서 적습니다.
1) gDNA를 transfer하기 전에 denaturation을 하셨는지 확인
2) gDNA의 양이 너무 적은거 같습니다.
Dot으로 control 한것으로 보아 probe 에는 문제가 없어 보입니다. (control DNA를 denaturation 후 Dot blot 하여 probe로 hybridization 하였다면)