KOSEN 한인과학기술자네트워크

정보 감사합니다. 간세포 분리 때 꼭 해보겠습니다. 보통 washing은 media로 하죠?

간세포 플레이트 한 뒤 40분 정도 뒤에 미디어를 빨아서 없애고 같은 디미어를 벽을 따라 조심스럽게 넣어 줍니다. 이렇게 하면 죽은세포가 씻겨서 없어집니다. 단점은 플레이트에 붙지 못한 간세포도 같이 없어지기도 합니다. 이럴경우는 조금 더 기다렸다가 워싱하면 됩니다. (시간은 실험을 해보셔서 정하시면 될 것 같습니다. 예를 들어, 40분에서 3시간 사이)

media를 제거 한 후 새 media를 넣고 한번 흔들어 준 후 다시 suction 후 새 media를 넣어 주었더니 확실히 세포의 상태가 좋아 지는 것을 확인 하였습니다.

축하합니다.

bacteria나 mycoplasm contam쪽은 아닌건가요?

현재 media 상태를 확인 했으시 특이점은 보이지 않고 있어서 contam쪽으로는 의심되지는 않습니다.

저도 contam 보다는 초기 정착이 잘 안된 것 같다는 생각이 듭니다..

rat-tail collagen coated plate 24 well (gibco)꺼를 사용하였습니다. 이전 수동으로 collagen coating한 24 well plate의 경우 이와 같은 문제가 발생하지 않았습니다.

미리 coating 되어 있는 plate의 사용 불량 well의 확인이 힘듭니다. 직접 코팅을 권해드리며 collagen I의 농도를 조금 높이시는 것도 좋습니다.

gibco 제품 collagen coated plate 24well 제품을 사용하였습니다. 지금 배양 상태가 같은 수의 cell을 seeding 하고 동일 media를 사용하였으나 well마다 cell 상태가 다른경우도 있습니다.

collagen 코팅이 균일한지를 점검하셔야 될 것 같습니다.
간세포들은 2kPa-5kPa stiffness의 부드러운 환경속에서 자라는 것으로 알려졌습니다.
well pate들은 GPa 정도로 stiff 해서 간세포에 적당하지 않은 것으로 알려졌습니다.

혹시 어떻게 점검해야 하는지 알수 있을까요?

collagen antibody로 처리하고 FITC로 된 2차 antibody로 처리하여 균일하게 코팅이 되었는지 con focal 내지 현미경으로 관찰하면 될 것 같습니다.

ExtraCellular Matrix의 역할을 collagen이 대신 해주고 있는것으로 알고 있는데요 그러면 이것이 초기에 hepatocyte가 collagen 표면에 달라 붙는 것이 제대로 달라 붙은 것이 아니기에 시간이 지남에 따라 세포가 위 사진 처럼 변했다는 건가요?

primary cell이구요 24 well에 culture 한 사진 입니다. 이 사진 외에도 유사한 현상이 나타난 well이 더 있구요 같은 well에 반은 죽어가는 cell과 반은 멀쩡한 cell이 공존하는등 상당히 이해하기 어려운 현상이 나타났습니다. 그리고 현재 새로 culture한 결과 유사한 현상이 또 발생하였습니다.

좋은 답변 해주셔서 감사합니다. 관련 코멘트에 꼭 문의 하겠습니다.