2016-03-23
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김형택(khtgood)
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transgenic mouse를 이용하여 prep을 하여 세포를 배양 중에 monolayer로 culture를 하면, GFP가 계속 꺼지는 현상을 관찰 하였습니다. 3D로 culture로 배양을 하면 조금 더 긴 시간동안 GFP가 유지되는 것을 관찰하였지만, 오랜시간이 되지 않아서GFP가 꺼지는 것을 관찰할 수 있었습니다. 처음에는 세포의 양상이 변화되어 GFP가 꺼졌을 것이다. 라고 가설을 세우고 세포 분화, PCR, ICC, Methylation분석을 진행하였습니다. 하지만, Positive control과는 별로 차이없는 data를 확인하였습니다. 그리고 추가로 해당 유전자에 대한 분석으로 PCR과 ICC를 진행을 하였더니 발현을 확인하는 것을 관찰하였습니다. 세포 배양시에 GFP가 꺼지는 현상이 발생하는 이유와 이런 현상에 대해 보충을 해줄수 있는 논문이 있는지 궁금합니다. 코센회원님들께서는 어떻게 생각하시는지 답변 부탁드립니다.
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답변 4
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답변
장성재님의 답변
2016-03-24- 2
어떤 transgenic mice를 사용하시는 지 몰라서 가능성이 있는 논문들을 검색하여 첨부합니다.
PCR 등으로 발현은 확인하셨는데 혹시 copy number도 확인하셨나요?
수고하세요~ -
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홍성욱님의 답변
2016-03-24- 2
어떤 transgenic인지 모르겠네요. 모든 세포가 GFP를 발현하게 만든 transgenic인가요 ?
GFP를 어떻게 확인하신건지도 중요할 것 같습니다.
Confocal과 같은 현미경을 사용하셔서 장시간 레이져에 노출시켰다면, GFP의 특성상 photobleaching으로 형광이 더이상 나타나지 않을 수 있습니다.
가능하시다면, western blot 등의 방법으로 GFP protein 발현 양을 확인하시는 것도 좋을 것 같습니다. -
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김상태님의 답변
2016-03-24- 1
보통 primary culture경우 유전자 소실이 급격히 증가하고 세포자체도 잘 유지가 안됩니다 -
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최수미님의 답변
2016-04-26- 1
제경우에는 GFP reporter stem cell line을 TALEN과 CAS9 으로 제작하여 분화를 유도하면서 20일간 매일 FACS로 GFP를 측정하였습니다. FBS를 포함한 세포 배양 컨디션이 GFP 발현에 도움이 되었고, 제작후 20회 이상의 split을 하면 signal이 약해졌습니다. 우선은 제작후 바로 사용하시기를 추천하고 FACS가 제일 효율적인 측정 방법같습니다.