2016-07-14
org.kosen.entty.User@2fd8b669
이열균(zipnine)
- 1
안녕하세요
제목처럼 BIO-LC(Thermo Dionex ICS-5000+)를 이용하여 당분석을 하려고 합니다.
분석하려는 당은 Fucose, Rhamnose, Galactose, Glucose, Xylose, Ribose, Mannose 7가지 입니다.
사용하는 컬럼은CarboPac PA1과 CarboPac SA10-4um 입니다. (Thermo dionex)
컬럼은 anion exchange resin으로 된 컬럼입니다.
detector는 ED(Au, reference Ag/AgCl)를 사용합니다.
우선 첫번째 문제점은 baseline의 변화입니다.
처음에 PA1컬럼을 사용하고 있었습니다. (SA10-4um컬럼은 최근 새로 구입)
조건은 0-50min 2mM NaOH(분리), 50-70min 200mM NaOH(세척), 70-90min 20mM NaOH(안정화), Flow rate은 1.0ml/min 입니다.
시간이 오래 걸려도 저위의 조건에서 7가지 당이 잘 분리되기에 (마지막에 Ribose는 피크가 많이 누워 버리긴 하지만..) 사용하고 있었는데.
어느날 부터인가 갑자기 분석 중간에 Baseline이 상승해버리는 현상이 있었습니다. 그래도 처음에는 40분이후부터(분리가 다된 후) 상승해서 상관없다고 생각하고 계속 사용하였는데, 이제는 분석하는 도중에 baseline이 갑자기 상승합니다.
상승해 버리는 시간도 그때 그떄 달라서, 우선은 200mM NaOH로 2시간 씻어주고, 2mM NaOH로 1시간 안정화 후, 물만 넣고 5번정도 찍어봤는데, 불규칙적인 시간으로 상승합니다. (1차-35분, 2차정상, 3,4,5차-25분대)
엔지니어도 원인을 모르겠다고 하고, 학술팀에서는 컬럼이 시료매트릭스 때문에 데미지를 입은것 같다고 했습니다.
(Bio-LC기기 및 컬럼 구입시기는 올해 3월입니다.) 사용도 테스트 포함 10set 정도 하였습니다.
시료는 미세조류를 2N 황산으로 당화를 시킨후 물로 100배 희석하여 사용하였습니다.
산도 때문에 데미지를 입어 컬럼이 망가졌다고 하는데, 저는 잘 모르겠습니다.
다른 논문에서 황산 또는 질산으로 당화시켜 ... 같은 컬럼으로 잘만 써서 논문을 냈는데...
이 이유가 맞는지가 제일 궁금합니다.
두번제 문제점은 시료의 전처리 입니다.
첫번째문제점이 사실이라면 시료의 산도를 중화 시켜 분석을 진행 해야 할것 같아서, 2N 황산으로 당화를 시킨 시료를 NaOH로 PH6~7로 중화를 시켰습니다. 그런데 하고 보니 Na2SO4는 염상태로 물에 잘 녹아 있는 상태 인데... 이상태로 100배희석하여 분석한다해도 SO4-의 영향으로 정량분석이 가능 한지가 의문입니다. (당분석시 당의 스탠다드 범위는 10ppm이하 입니다.)
2N 황산으로 당화시킨 시료를 Bio-LC에 맞게 전처리를 어떻게 해야 할지 전혀 감이 안잡합니다.
중화를 NaOH로 하지 않고 Ca(OH)2로 하여 CaSO4를 형성시켜 침전하게 하여 염을 수거한 후 사용 해야 할까요? CaSO4가 물에 잘 녹지 않고 수거가 잘 될 수 있나요?
세번째 문제점은 다른 기기보다 정량적으로 차이가 심하게 납니다.
제가 지금하고 있는 당분석은 원래 HPLC로 BIORAD사의 컬럼을 이용하여 분석을 했습니다.
하지만 이 컬럼은 Xylose, Mannose, Galactose를 분리를 하지 못하여 Thermo의 Bio-LC로 분석을 하게 되었습니다.
그런데 두개의 분석기기로 분석하고 결과값을 보니 HPLC에 비해 Bio-LC가 당 분리정도는 훨씬 좋지만 정량적으로 다 낮게 분석이 됩니다. 전체적으로 같은 비율로 낮은 것도 아니고 각각 다른 비율로 정량적인 차이가 납니다. 그리고 전체적 당의 총량도 차이가 납니다.
어떻게 이해를 해야 할지 모르겠습니다.
BIO-LC가 피크의 분리도가 좋지만 희석을 100~1000배 하기때문에 오차가 커서 믿을 수 없다.
HPLC는 시료 원액 또는 2배 희석하여 사용 하여 오차가 없지만 피크분리도가 매우 좋지 않아 믿을 수 없다. (피크 5개가 낙타등 처럼 나옴...)
그래서 정량적으로 Bio-LC가 낮게 나오는 원인이 제가 두번째에서 문제점으로 말한 부분이 영향을 미치고 있지 않을까 싶습니다. (시료안의 SO4-로 인한 컬럼 capasity감소..)
마지막으로 한가지더....
같은기기로 당분석을 하는 다른 곳에서는 (시료가 다른 분야이지만..) 당화(산분해)를 위해 염산 또는 TFA를 사용하고, speedvac으로 날린 후, 물에 녹여 분석을 한다고 합니다.
좀 바보 같은 질문이라고 생각하지만, speedvac을 이용하면 산이 기화하여 없어지는건가요?
HCl와 TFA에만 적용되는 건가요....
지금 시료의 산도가 문제고 그렇다고 하면 중화 후의 염이 문제고.. 해서요..
질산, 황산도 speedvac으로 기화가 가능할까요?
긴글 읽어주셔서 감사합니다.
답변 꼭 좀 부탁드립니다.. 의견이라도... 부탁드립니다.
제목처럼 BIO-LC(Thermo Dionex ICS-5000+)를 이용하여 당분석을 하려고 합니다.
분석하려는 당은 Fucose, Rhamnose, Galactose, Glucose, Xylose, Ribose, Mannose 7가지 입니다.
사용하는 컬럼은CarboPac PA1과 CarboPac SA10-4um 입니다. (Thermo dionex)
컬럼은 anion exchange resin으로 된 컬럼입니다.
detector는 ED(Au, reference Ag/AgCl)를 사용합니다.
우선 첫번째 문제점은 baseline의 변화입니다.
처음에 PA1컬럼을 사용하고 있었습니다. (SA10-4um컬럼은 최근 새로 구입)
조건은 0-50min 2mM NaOH(분리), 50-70min 200mM NaOH(세척), 70-90min 20mM NaOH(안정화), Flow rate은 1.0ml/min 입니다.
시간이 오래 걸려도 저위의 조건에서 7가지 당이 잘 분리되기에 (마지막에 Ribose는 피크가 많이 누워 버리긴 하지만..) 사용하고 있었는데.
어느날 부터인가 갑자기 분석 중간에 Baseline이 상승해버리는 현상이 있었습니다. 그래도 처음에는 40분이후부터(분리가 다된 후) 상승해서 상관없다고 생각하고 계속 사용하였는데, 이제는 분석하는 도중에 baseline이 갑자기 상승합니다.
상승해 버리는 시간도 그때 그떄 달라서, 우선은 200mM NaOH로 2시간 씻어주고, 2mM NaOH로 1시간 안정화 후, 물만 넣고 5번정도 찍어봤는데, 불규칙적인 시간으로 상승합니다. (1차-35분, 2차정상, 3,4,5차-25분대)
엔지니어도 원인을 모르겠다고 하고, 학술팀에서는 컬럼이 시료매트릭스 때문에 데미지를 입은것 같다고 했습니다.
(Bio-LC기기 및 컬럼 구입시기는 올해 3월입니다.) 사용도 테스트 포함 10set 정도 하였습니다.
시료는 미세조류를 2N 황산으로 당화를 시킨후 물로 100배 희석하여 사용하였습니다.
산도 때문에 데미지를 입어 컬럼이 망가졌다고 하는데, 저는 잘 모르겠습니다.
다른 논문에서 황산 또는 질산으로 당화시켜 ... 같은 컬럼으로 잘만 써서 논문을 냈는데...
이 이유가 맞는지가 제일 궁금합니다.
두번제 문제점은 시료의 전처리 입니다.
첫번째문제점이 사실이라면 시료의 산도를 중화 시켜 분석을 진행 해야 할것 같아서, 2N 황산으로 당화를 시킨 시료를 NaOH로 PH6~7로 중화를 시켰습니다. 그런데 하고 보니 Na2SO4는 염상태로 물에 잘 녹아 있는 상태 인데... 이상태로 100배희석하여 분석한다해도 SO4-의 영향으로 정량분석이 가능 한지가 의문입니다. (당분석시 당의 스탠다드 범위는 10ppm이하 입니다.)
2N 황산으로 당화시킨 시료를 Bio-LC에 맞게 전처리를 어떻게 해야 할지 전혀 감이 안잡합니다.
중화를 NaOH로 하지 않고 Ca(OH)2로 하여 CaSO4를 형성시켜 침전하게 하여 염을 수거한 후 사용 해야 할까요? CaSO4가 물에 잘 녹지 않고 수거가 잘 될 수 있나요?
세번째 문제점은 다른 기기보다 정량적으로 차이가 심하게 납니다.
제가 지금하고 있는 당분석은 원래 HPLC로 BIORAD사의 컬럼을 이용하여 분석을 했습니다.
하지만 이 컬럼은 Xylose, Mannose, Galactose를 분리를 하지 못하여 Thermo의 Bio-LC로 분석을 하게 되었습니다.
그런데 두개의 분석기기로 분석하고 결과값을 보니 HPLC에 비해 Bio-LC가 당 분리정도는 훨씬 좋지만 정량적으로 다 낮게 분석이 됩니다. 전체적으로 같은 비율로 낮은 것도 아니고 각각 다른 비율로 정량적인 차이가 납니다. 그리고 전체적 당의 총량도 차이가 납니다.
어떻게 이해를 해야 할지 모르겠습니다.
BIO-LC가 피크의 분리도가 좋지만 희석을 100~1000배 하기때문에 오차가 커서 믿을 수 없다.
HPLC는 시료 원액 또는 2배 희석하여 사용 하여 오차가 없지만 피크분리도가 매우 좋지 않아 믿을 수 없다. (피크 5개가 낙타등 처럼 나옴...)
그래서 정량적으로 Bio-LC가 낮게 나오는 원인이 제가 두번째에서 문제점으로 말한 부분이 영향을 미치고 있지 않을까 싶습니다. (시료안의 SO4-로 인한 컬럼 capasity감소..)
마지막으로 한가지더....
같은기기로 당분석을 하는 다른 곳에서는 (시료가 다른 분야이지만..) 당화(산분해)를 위해 염산 또는 TFA를 사용하고, speedvac으로 날린 후, 물에 녹여 분석을 한다고 합니다.
좀 바보 같은 질문이라고 생각하지만, speedvac을 이용하면 산이 기화하여 없어지는건가요?
HCl와 TFA에만 적용되는 건가요....
지금 시료의 산도가 문제고 그렇다고 하면 중화 후의 염이 문제고.. 해서요..
질산, 황산도 speedvac으로 기화가 가능할까요?
긴글 읽어주셔서 감사합니다.
답변 꼭 좀 부탁드립니다.. 의견이라도... 부탁드립니다.
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답변 1
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답변
이상후님의 답변
2016-07-15- 1
시중에 판매되는 NaOH펠렛은 sodium carbonate의 얇은 막으로 코팅되어 있기 때문에, pH 12이상의 조건에서는 2가 음이온을 띄어서 컬럼하고 강하게 결합하여 분리하고자 하는 단당류들의 결합을 방해할 수 있습니다. 결국 컬럼 선택성을 떨어트리고 분해능이 떨어질 수 있습니다. 이런 현상 때문에 baseline이 불안정해 질 수도 있을 거 같습니다. 이런 문제를 해결하기 위해서 50% w/w NaOH용액을 만들어 사용하는 방법이 있습니다. 그런데 50% NaOH용액을 만든 후에 바닦에 가라 않는 침전물들은 carbonate이온을 다량 포함하고 있기 때문에 아랫부분은 사용하지 말아야 합니다.
thrmo사에서도 NaOH 펠렛 사용은 권장하지 않아서 50% 수용액 제품을 구매하여 사용하고 있습니다. 답변 감사합니다.