2016-07-28
org.kosen.entty.User@40b44be9
김주동(syncn310)
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gene cloning을 처음하고 있는데 현재 cDNA를 사용하여 TARGET GENE을 PCR하는 과정에서 몇가지 문제가 생겨 질문을 드립니다~
mouse bone marrow에서 cell을 뽑은 다음 분화시켜 RNA를 분리 후 olido dt를 사용하여 cDNA 합성 후 실험을 하고 있었습니다.
그런데 sequencing 확인 결과 깔끔한 결과가 나오지 않아 문제점은 개선하고자 알아보던 중 oligo dt가 의심되어 cDNA 합성시 사용하던 oligo dt대신 random primer를 사용하여 cDNA를 합성하였고 합성 후 GAPDH를 확인한 결과 random primer에서는 확실히 band가 나왔으나 oligo dt를 사용한 cDNA는 band가 뜨지 않았습니다.
그래서 그 이후로 random primer를 사용하여 cDNA를 만들고 실험을 진행하였는데 oligo에서 random primer로 바꾼 이후부터 target gene의 band가 아예 뜨지 않습니다.
oligo dt를 사용하던 경우 PCR을 하고나면 band는 잘 나왔는데 어느 순간부터 좀 잘 안나오기 시작하고 sequencing도 깔끔하게 나오지 않아서 random primer로 바꿨는데 그 이후부터는 아예 band조차 뜨지 않습니다.
질문의 요점은 oligo dt를 사용한 cDNA때 사용한 target gene primer (forward , reverse)를 random primer를 사용하여 cDNA 합성 시 사용하던 primer를 그대로 사용해도 되는가 하는게 궁금합니다~ 혹시나 사용하던 target gene primer가 이상이 생겼나 싶어 새로 주문해봤지만 결과는 마찬가지였습니다~ ㅜㅜ
혹시 해결방안이 있으신 분들은 꼭 좀 조언 부탁드리겠습니다. 참고로 해당 target gene의 크기는 1700bp입니다.
mouse bone marrow에서 cell을 뽑은 다음 분화시켜 RNA를 분리 후 olido dt를 사용하여 cDNA 합성 후 실험을 하고 있었습니다.
그런데 sequencing 확인 결과 깔끔한 결과가 나오지 않아 문제점은 개선하고자 알아보던 중 oligo dt가 의심되어 cDNA 합성시 사용하던 oligo dt대신 random primer를 사용하여 cDNA를 합성하였고 합성 후 GAPDH를 확인한 결과 random primer에서는 확실히 band가 나왔으나 oligo dt를 사용한 cDNA는 band가 뜨지 않았습니다.
그래서 그 이후로 random primer를 사용하여 cDNA를 만들고 실험을 진행하였는데 oligo에서 random primer로 바꾼 이후부터 target gene의 band가 아예 뜨지 않습니다.
oligo dt를 사용하던 경우 PCR을 하고나면 band는 잘 나왔는데 어느 순간부터 좀 잘 안나오기 시작하고 sequencing도 깔끔하게 나오지 않아서 random primer로 바꿨는데 그 이후부터는 아예 band조차 뜨지 않습니다.
질문의 요점은 oligo dt를 사용한 cDNA때 사용한 target gene primer (forward , reverse)를 random primer를 사용하여 cDNA 합성 시 사용하던 primer를 그대로 사용해도 되는가 하는게 궁금합니다~ 혹시나 사용하던 target gene primer가 이상이 생겼나 싶어 새로 주문해봤지만 결과는 마찬가지였습니다~ ㅜㅜ
혹시 해결방안이 있으신 분들은 꼭 좀 조언 부탁드리겠습니다. 참고로 해당 target gene의 크기는 1700bp입니다.
- RT-PCR
- Primer
- cDNA
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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답변
장성재님의 답변
2016-07-29- 3
oligo-dT의 경우 cDNA 합성 시 표적이 되는 것은 poly-A tail을 가지고 있는 mRNA입니다.
random hexamer의 경우 mRNA 이외에도 rRNA, tRNA 또는 contaminated DNA도 표적이 될 수 있습니다. 따라서 cDNA 합성 시에 total RNA를 사용하는지 또는 시판되는 kit를 사용해서 분리 정제한 mRNA를 사용하는 지에 따라서 결과가 다를 수는 있습니다.
주된 질문 포인트인 "oligo dt를 사용한 cDNA에 적용시킨 target gene primer (forward , reverse)를 random primer를 사용한 cDNA에 그대로 사용해도 되는가"에 대한 것은 sequence를 정확히 확인해봐야 하겠지만, 별 무리는 없을 것으로 보입니다.
나오다가 안나온다는 점이 의심스러운데 전체적으로 바뀐 부분이 있나 꼼꼼히 검토해보시는 것과 target gene의 사이즈가 비교적 크므로 PCR 조건(primer, enzyme, temp. 등)을 한번 더 검토해보시는 것은 어떨까 합니다.
제 경험으론 유명 회사의 enzyme도 batch에 따라서 activity 등이 차이가 났었던 적도 있고 오래 보관하던 primer 또는 새로 주문한 primer에 변형이 생긴 경우도 있었습니다. -
답변
오요한님의 답변
2016-11-01- 1
일단, 제가 보기에는 target size가 나름 긴 편에 속합니다. (1.7kb)
질문자님께서 RNA isolation을 하실때 condition에 따라 RNA fragments size가 결정됩니다.
만약 어느정도의 이상의 물리력이 작용했다면 RNA들이 많이 조각나는데,
그러면 oligo-dT보다 random hexamer가 target을 잡을 확률도 높아집니다.
왜냐하면 합성된 oligo-dT의 경우 항상 mRNA의 3'-end부터 cDNA합성을 시작하지만,
random hexamer는 mRNA 어느 부분에서든 cDNA 합성을 할 수 있기때문이죠.
하지만 size가 커지면 이 또한 의미가 줄어들죠.
그런의미에서 target size가 커지면 gene specific primer를 사용하시길 추천드립니다.
원래 targeting했던 primer pair에서 reverse primer보다 조금 더 3'쪽으로 이동한 위치에 해당하는
15~20mer정도의 primer를 이용해 (oligo-dT나 random hexamer 대신 이용하시면 됩니다)
cDNA를 합성하시고 PCR해 보시기 바랍니다.
경험상 PCR용으로 제작해둔 reverse primer자체를 이용해 cDNA합성을 해도 성공적으로 cloning에 성공했습니다.
(7.6kb까지 성공해 봤습니다)
Target을 PCR하기 위해 제작해두신 Forward/Reverse primer는 RT-reaction에 사용되는 primer의 종류에
상관없이 모두 사용하실 수 있습니다.
이상의 모든 과정은 아마 사용하시는 RTase kit에 자세히 설명되어 있을 것입니다.
사용하시는 primer 종류에 따라 (oligo-dT, random hexamer, gene specific primer) 반응 조건이 다르니,
제조사에서 제공하는 설명서의 사항들을 꼭 지켜주시기 바랍니다.
감사합니다.
답변 감사드립니다. 다시 한번 처음부터 검토를 해봐야 할 것 같네요~ 말씀해주신 PCR조건은 이미 몇번 band가 나왔었기 때문에 문제는 없는 것으로 보입니다. 혹시 모르니 다시 새로운 oligo dt를 사용해서 cDNA를 합성하여 실험을 진행해 봐야 할 것 같네요~ 다시 한번 답변 감사드립니다~ 다시 검토 후 재실험 해야겠네요~^^;;;