2016-08-08
org.kosen.entty.User@3dc40e4e
임승애(dotoro2327)
- 4
cGAMP 생성 양을 HPLC-MSMS를 통하여 분석하고자 합니다.
아래 내용은 테크니션에게 받은 sample precipitation 방법입니다.
I would suggest first to test ptecipitation by adding 5vol of methanol to your sample place it at minus 20 deg for two hours than centrifuge at High speed eg 15000rpm.
At cold temperature obviously the centrifugation. Keep the supernatant.
1. 이 경우 sample을 약 2주간 보관한 뒤 분석하고자 하는데 가능할까요?
2. 만약 가능하다면 어떤 방법으로 샘플을 보관해야 할까요? 현재 생각하고 있는 방법은 sample precipitation 후 1.7ml eppendorf tube에 넣은 뒤 -80'C 보관 입니다.
혹시 더 좋은 방법을 아신다면 설명 부탁드립니다.
감사합니다.
아래 내용은 테크니션에게 받은 sample precipitation 방법입니다.
I would suggest first to test ptecipitation by adding 5vol of methanol to your sample place it at minus 20 deg for two hours than centrifuge at High speed eg 15000rpm.
At cold temperature obviously the centrifugation. Keep the supernatant.
1. 이 경우 sample을 약 2주간 보관한 뒤 분석하고자 하는데 가능할까요?
2. 만약 가능하다면 어떤 방법으로 샘플을 보관해야 할까요? 현재 생각하고 있는 방법은 sample precipitation 후 1.7ml eppendorf tube에 넣은 뒤 -80'C 보관 입니다.
혹시 더 좋은 방법을 아신다면 설명 부탁드립니다.
감사합니다.
- HPLC-MSMS
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 4
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답변
이경인님의 답변
2016-08-08- 2
2주정도라면, -80C보다는 -20C 정도를 권장하고 싶습니다.
위의 방법대로 methanol로 처리하게 되면 대부분의 분석방해물질과 변질가능 성분들이 침전으로서 제거됩니다.
다만 분석을 시행하실 때 시료의 수가 많다면 분석 장비의 autosampler의 조건을 확인하시어 저온 유지기능이 없을 경우의 분석 스케쥴에 대해 협의를 하시는 것이 좋을 것입니다.
이런 경우 -80C보다는 -20C가 분석시 온도와 차이가 덜하여 시료들 간의 균질성 확보에 도움이 될 수 있으며, -80C와 같이 극도로 낮은 온도에서 동결되는 성분이 있거나 온도 편차에 의한 성분 변화도 간혹 있을 수도 있으니 1달 이상 장기간 보관하실 것이 아니라면 -20C정도가 여러모로 좋을 것입니다. -
답변
이상후님의 답변
2016-08-09- 1
테크니션의 레커멘데이션 내용을 보니, methanol 첨가 후 약 2시간 동안 -20'C에 보관 후 15,000 rpm으로 원심분리를 하라는 내용인 거 같은데, MeOH 첨가 목적은 분석에 방해가 되는 단백질류나 펩타이드 또는 다당/올리고당류를 침전시키기 위한 거 같습니다. 원심분리 후 supernatant에는 methanol이 섞여 있기 때문에 -20'C에 넣어도 얼지는 않을 거 같은데요.
원래 표준물질 상태의 cGAMP가 lyophilized 상태라면 -20'C에서 1년간 안정하다고 알려져 있고, 용매에 녹여져 있는 상태라면 -20'C에서 6개월간 안정하다고 알려져 있습니다. 냉-해동을 반복하지 않는다면 -20'C에 2주간 보관해도 안정할 거 같습니다만, 직접 생물학적 체액 또는 기타 소스에서 분리하신 상태라면 시료액중에 포함된 unknonw 효소(메탄올 첨가로 침전되지 않을 수 있는)들에 의해 -20'C에서 얼지 않는 상태에서 안정성에 영향을 줄 수 있기 때문에 -80'C에 보관하는 것이 가장 확실한 방법인듯 합니다. -
답변
김동현님의 답변
2016-08-10- 1
일반적인 표적 대사체 분석을 하시는 것 같은데요. 시료준비 프로토콜 또한 전형적인 대사체 분석 준비로 보이네요. 우선 말씀드리고 싶은 것은 메탄올을 첨가하실 때에도 메탄올을 꼭 미리 차갑게 온도를 내려놓는 것이 좋습니다. 시료준비 시 가장 중요한 점은 시료준비 처음부터 끝까지 항상 저온상태를 유지해야 한다는 것입니다. 저의 대사체학 분야에서의 10년이상 경험으로 말씀드리자면 먄약 시료가 생물학적 시료이라면 -80에 보관하는 것이 훨씬 안정적입니다. 메탄올을 이용하여 침전을 시킨다하더라도 모든 효소를 100% 제거한다는 보장이 없기 때문에 -20도에서도 효소반응이 (아주 천천히 일어나지만) 일어날 수 있습니다. -
답변
장미옥님의 답변
2016-08-15- 1
dotoro2327님이 생물학적 시료 분석을 기초로 하신다면 -80도 보관이 안정적일 것 같습니다
이론상으로는 -20도도 일 주일 내지는 2주까지는 시료 보관이 가능하다고는 하는데 실제 실험에 적용해보면 냉동과 해동을 반복하지 않더라도 실험결과가 다른 경우 많이 봤습니다
심지어는 -80도에서도 그런 경우들이 종종 있어서 완전히 안정하다고 보기는 어렵지만 그래도 -20 보다는 -80도에 시료를 보관하는 것이 보다 정확한 실험 결과를 도출할 수 있지 않을까 생각됩니다