2016-08-16
org.kosen.entty.User@2a0789c8
윤소영(qqpq)
- 2
BDNF promoter chip assay (in vitro (m))를 하고 있는데요.
아래보이는 시퀀스에서 제가 나누어서 프라이머를 만들었습니다.
그래서 qRT-PCR을 했는데요. 여기서 delta-delta CT를 구해야만 밴드가 뜬게 맞는지
즉 binding을 하는지 알수 있을거 같은데요. housekeeping gene을 비교해야 정확히 뜬것인지
아지면 잡밴드인지 확인이 가능할거 같은데요. 어떻게 분석을 해야 하나요...
RSAT - retrieve-ensembl-seq result
Processing your retrieve-ensembl-seq request...아래보이는 시퀀스에서 제가 나누어서 프라이머를 만들었습니다.
그래서 qRT-PCR을 했는데요. 여기서 delta-delta CT를 구해야만 밴드가 뜬게 맞는지
즉 binding을 하는지 알수 있을거 같은데요. housekeeping gene을 비교해야 정확히 뜬것인지
아지면 잡밴드인지 확인이 가능할거 같은데요. 어떻게 분석을 해야 하나요...
RSAT - retrieve-ensembl-seq result
| Job ID | apache/2015/04/24/retrieve-ensembl-seq_2015-04-24.072115_zYOPCh |
| Submitted at | 7:21:16, Fri Apr 24, 2015 |
BDNF promoter sequence
GAACTTACTAACAGCATGATGAATTGCATTCTCAGGAAACTGGCTTTTCTCACATAACCT -2000
GTACCCCAAGACCTCTGAAGATGGCTTATGCCAGCTGTCTTAGTCTTAGGGCAGCATCTG
CTGGCTAATTCATGGATGGACAAAAAGTGACAATTTATGAACAATATGAACAGTGTTGTT
TCTTTTTTATTTGATTTTTGTTTTTTGTTTTTAGCTGGAGGTAACTGTTGCCTTGGTGAC
TGTAACTGGTGGATGGTATTCTCTAAGTGATGATGCACACCAGGTCACCAAGAGCCTCTA
AGAGGTAAAGAAAGCCTTTGTACAAATATATGTTGGCTGGAGCCTAGAATGATCTGGGTT
GACTTTGAAAACATCTCTTTAGGGGTGCATATGAATGCGCAACACTGGATTTACTGCTAA
TACTAATAATCTAGTACCAATGGAGAGTCCAAGAACAGAACTTCACAGAAGGCATTAAGG
AAGTAACGCTTAGGTTTCTTTAAAGAAGCATTCTTAGGATAGGAGGGGGAGGGGACCTGA
ACCTTGAAGCAGCCACTGCATGCTAATGTTCTTCAAACTCATCCTATGTATAACTCTGAT
TTTATACACCAAGAACTACGAATTCCCTTCAAACACAGCACATTTGATTTGATTAAAGAA
ACAGAAATTTTAAAGGACTGGGTGGTCCAAAACTTCAGAGCTATCCACCATCTTCCGCAA
CATCTCCCTGCCTCATCCCTGCAGTCAATAGCGCCACAGCCAGGGCCAGTGATGCCTTTG
GTGGGGTCCATTGGTGGGAACTCCAGAGGAAGAGCAAAATCATGGTGTCGGCACCAAACC-1220
GGGGAAACCTGAAAAGCAGCGTCCGGGGACTTCCCAGGGCACTCGCACTCATCCGAGCTG(-1100~-1000)
CGGGTATCTCCATAACAACTGGTTTACATTACATTCATTCTCGGCTCCTCTGCTTCGCTG
CGTAAGCTAAGCTGAGGGTAGGCAAAGGAAGACTCTAGTGAAGAGATACCTGGAGCTAGC
GCCTCCCTATGTTGGGGGATATGGTTAACTCTGGACTTACAGCTCATTTCTAGAGATTTC
CGGACATCTGCCTAGGATCTCAGCCTAAGGGCCTTGCCCTTCCCCCACTGCACCCCTCCC
CCACCGCATCCGCCTTTCAAGAGATTATTTTTACACGCCCGCGCACACGCGCACACACAT
ACGGGGGGAGGAGGTTTATTTTATTGTGACTCTTCTTGAAGTTCATCTCTTTCCTTCCAA
CTTACTTTCCTCCAACACGTGACCTCTCCACTTCCCAGCCTGCGCAGTCACTAGTGGGAA
GTGTAGTGGCCAGCGCGAGGCTTCCTGGGAGAGCCCCCCCGCCCGAAGCCCACCTCCTGG
AGCTTGCGGCTTCAGTTCTCAACCCCGGGAAGCACCCAAAATAGGGCAGCGACTCTGGGG-620
AGGAAGCACGGAGCCGGAGCCGACGCGGAGCTGGGAGACTAGCGCCGATCTTCCCCTCCT
AGCCTACACCTTTTCGCTCAGAGCTCCAGGGCGGACCTAGCCGCGCACAGAGGCTGTTAA
CTCTCATTTGAGAAGCCATAAGCCATTAGAGCAAACGCAGTCATAACTTCATTCAACTCA
AGCCGCTTGAGAGCTTGGCTTGCACAGGTTCCTGTGGGCAACTAGTGGCTCGCCCGGGTG
CCTCTCGCCTAGTCATCAGTCCCTAAGAGGAAAAGGGAAAGTTGTGGGGCTGATGCGCTC
TTCGATTCACGCAGTTGTTCCCTAGAACAAGTCACTCCCGCTCCATCACCCAGCCCCCCC
CCCCCCTCCCATTTGATCATCACTCACGACCACGTCCGCTGGAGACCCTTAGTCATGGTG
GGGGAGGGGCACGAACTTTTCTAAGAAGTTTCCTTTTTACCAAGGGAGTCACAGTGAGTT
GGTCACGTAACTGGCTCAGAGAGGCTGCCCTGGCCCCCTCCCCTCGCCCCCTCCCCGCTG
CGCTTTTCTGGTATTCTTAT
- chip assay
- DNA
- Promoter
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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답변
장성재님의 답변
2016-08-17- 1
qRT-PCR의 경우 delta-delta CT를 구한다는 것은 internal control (housekeeping gene)과의 보정 및 대조군(약물 등의 처리 시 무처리군)과의 비교를 통한 상대적인 정량값을 얻는 것입니다. qRT-PCR 관련 메뉴얼 등을 확인하시면 타겟 유전자가 삽입된 plasmid 등을 이용하여 절대 정량값을 구하는 방법도 나와 있으니 참고하세요.
하지만, 중간 중간에 intron이 많거나 splicing variants를 포함하는 타겟 유전자의 경우 한 쌍의 primer를 사용한 qRT-PCR만으로는 제대로 된 발현량 측정이 어려울 수 있으니 full sequence에 대한 primer를 제작하여 agarose gel 상에서 band를 확인하시는 것도 좋습니다. -
답변
이상열님의 답변
2016-08-21- 1
아래처럼 한번 확인하세요...
1. 위에 언급하신 유전자 서열을 기준으로 qRT-PCR에 대한 primer를 디자인하신 후
2. Control 샘플로 PCR의 quality를 확인하시고
3. qRT-PCR을 하신 후 qRT-PCR의 여부를 전기영동으로 확인하시는 것도 좋습니다.
4. 물론 qRT-PCR을 하실때 당연히 housekeeping gene을 사용하셔야 하고 이때 2개 이상의 housekeeping을 사용하시는 것을 추천드립니다. 그리고 delta delta CT 구하신 후 분석으로 결정하시면 됩니다.
5. qRT-PCR후 PCR error에 대한 우려를 피하기 위해서 PCR product 사이에 binding하는 probe를 디자인하셔서 사용하시면 그 우려를 줄일수 있습니다.
이와 같이 해보시는 것을 추천드리고 만약 자세한 부분이 필요하시면 연락을 주십시요...