2016-10-25
org.kosen.entty.User@39ee41a7
원아영(way1981)
- 4
현재 gDNA를 template로 하여 real time PCR을 진행하고 있습니다.
처음 해보는 실험이라서 기본 테크닉에 대한 trouble shooting이 부족한 것인지,
NTC가 CT값 30~35에서 일정하게 뜹니다.
Primer와 probe를 이용하여 실험하고 있으며,
probe에는 FAM, HEX를 붙여서 검출하고 있습니다.
gDNA를 serial dilution 하였을때, 일정한 CT값의 차이를 보이며 직선성과 민감성은 좋게 나타나는데,
NTC가 일정하게 30 ~35CT에서 나타납니다.
RFU값은 낮은 편이지만,
정량한계를 보여줘야 하는 데이타라서 NTC에 가까운 농도 수준의 CT값도 보여줘야 하는데
차이는 분명히 있지만,,, 너무 가까워서 문제인것 같습니다.
contamination을 가장 먼저 고려하여,
주변을 10% 락스로 청소하고,
파이펫도 새것으로 교체하고,
필터팁을 사용하나, 팁도 새로 뜯었으며,
프라이머와 taq mixture도 새것으로 진행하였습니다.
프라이머와 probe set도 다시 제작하기를 3번째 변경해 보았습니다.
primer 조건을 잡기 위해 gradient로 진행하여 조건을 잡은 것이구요..
probe로 검출하는 것이라서
primer dimer 부분에 대한 가능성에 대한 부분은 거의 배제할 수 있지 않나 생각하였으나,
혹시나 하여 UDG taq mixture를 사용하였음에도 여전히 NTC가 나타납니다.
2주째, 기본적인 Trouble shooting 방법은 시도해 보았으나
해결이 되지 않아 이렇게 문의글을 올립니다.
뭔가 기본적인 것을 놓치는 것인지..
조언부탁드립니다.
추가적으로 필요한 정보가 있다면 답변드리겠습니다.
감사합니다.
처음 해보는 실험이라서 기본 테크닉에 대한 trouble shooting이 부족한 것인지,
NTC가 CT값 30~35에서 일정하게 뜹니다.
Primer와 probe를 이용하여 실험하고 있으며,
probe에는 FAM, HEX를 붙여서 검출하고 있습니다.
gDNA를 serial dilution 하였을때, 일정한 CT값의 차이를 보이며 직선성과 민감성은 좋게 나타나는데,
NTC가 일정하게 30 ~35CT에서 나타납니다.
RFU값은 낮은 편이지만,
정량한계를 보여줘야 하는 데이타라서 NTC에 가까운 농도 수준의 CT값도 보여줘야 하는데
차이는 분명히 있지만,,, 너무 가까워서 문제인것 같습니다.
contamination을 가장 먼저 고려하여,
주변을 10% 락스로 청소하고,
파이펫도 새것으로 교체하고,
필터팁을 사용하나, 팁도 새로 뜯었으며,
프라이머와 taq mixture도 새것으로 진행하였습니다.
프라이머와 probe set도 다시 제작하기를 3번째 변경해 보았습니다.
primer 조건을 잡기 위해 gradient로 진행하여 조건을 잡은 것이구요..
probe로 검출하는 것이라서
primer dimer 부분에 대한 가능성에 대한 부분은 거의 배제할 수 있지 않나 생각하였으나,
혹시나 하여 UDG taq mixture를 사용하였음에도 여전히 NTC가 나타납니다.
2주째, 기본적인 Trouble shooting 방법은 시도해 보았으나
해결이 되지 않아 이렇게 문의글을 올립니다.
뭔가 기본적인 것을 놓치는 것인지..
조언부탁드립니다.
추가적으로 필요한 정보가 있다면 답변드리겠습니다.
감사합니다.
- real-time PCR
- NTC
- probe
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변 4
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답변
장성재님의 답변
2016-10-26- 1
1. water 오염
2. primer 오염 또는 self dimer 형성
3. master mix 오염
위의 3가지를 고려해 볼 수 있습니다.
각각의 factor를 변경 후 PCR을 돌려보면 확인할 수 있겠지요.
아니면 agarose gel에 올려 밴드를 sequencing 해보는 방법도~ -
답변
오요한님의 답변
2016-10-27- 1
틀릴 수 있으나, denaturation step의 시간이 너무 길어서가 아닐까 추측됩니다.
겸험상 2초정도의 denaturation 만으로도 좋은 realtime-PCR 결과들을 얻었습니다.
Denaturation step의 시간을 줄이는 것으로 trouble shooting이 될 수도 있지 않을까 생각합니다.
제가 이런 생각을 하는 이유는, TaqMan계열의 probe의 경우 quencher와 형광dye의 분리에 의해 signal이 나오게 되어있는데,
고온 (~95oC) 조건을 35 cycle이상 반복하여 일정시간 이상의 고온이 probe에 가해지게 된다면,
probe자체에서 형광dye와 quencher사이의 어떤 공유결합이라도 끊어지게된다면,
충분히 non-specific signal이 나올 수 있다고 생각합니다.
물론, 사견일 뿐이고 경험이 있는 것은 아닙니다.
질문자님의 문제가 빨리 해결되시기를 바라겠습니다.
감사합니다. -
답변
박진성님의 답변
2016-10-28- 1
제 경험상,
1. primer를 녹일때와 mixture만들때 쓰는 물을 PCR용으로 구매하니, 약간 올라간 적이 있습니다.
그리고, PCR용으로 쓴다고 3차 증류수 또는 PCR용 물을 autoclave해서 분주한 뒤 얼려쓰는게 더 안좋을 수 있습니다. 혹시나 존재할지도 모르는 오염물질이 깨져서 물이 더 더러워질 수 있습니다.
2. 또 한가지는 장비입니다.
저는 장비를 여러가지로 써봤는데, 장비스펙에 따라, 그리고 브랜드에 따라 약간씩 차이가 납니다. 적용가능한 다른 장비가 있으면 다른 곳에서 테스트 해보심을 추천합니다.
장비에 따라 님이 나오는 결과가 원래 NTC에서 잡히는 결과일 수 있습니다.
(제 경험입니다.) -
답변
임창임님의 답변
2016-11-16- 1
다른 분들 조언대로
첫째, DW 오염
둘째, 프라이머 다이머일 가능성이 있습니다.
저라면, PCR product를 아가로스 젤에 내려보겠습니다.
그리고 DNA template는 조금 늘려보고, Anealing 온도를 조금 더 높여 볼 것입니다.