2017-02-09
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김옥화(kah3173)
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논문에서 제시하고 있는 qPCR 혹은 PCR primer를 blast로 확인시 대부분 잘 맞지 않거나 재연성이 없는 경우가 많습니다. 또한 sequence를 제대로 확인하여 primer를 제작해서 qPCR을 수행했을 경우에 melting point의 peak가 한개의 peak로 나오는 경우에도 반복적인 실험을 수행했을 때 다른 결과가 나오는 경우가 많습니다.
primer 제작 후에 제대로된 primer인지 확인할 수 있는 방법이 있을까요?
커머셜하게 판매되는 primer를 구매해서 사용하는것에 한계가 있을 경우 primer제작 시 고려해야할 사항이 있다면 알려주시면 감사하겠습니다.
primer 제작 후에 제대로된 primer인지 확인할 수 있는 방법이 있을까요?
커머셜하게 판매되는 primer를 구매해서 사용하는것에 한계가 있을 경우 primer제작 시 고려해야할 사항이 있다면 알려주시면 감사하겠습니다.
- qPCR
- primer 제작
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 4
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답변
윤창호님의 답변
2017-02-10- 2
일반적인 고려조건은
1. Tm 값의 유사: pair한 primer의 Tm 값이 비슷해야 annealing temperature를 동일하게 적용하여 specific한 증폭을 할 수 있습니다. 또한 한 plate에 다른 유전자를 같이 증폭하기에 서로 비슷하게 맞추는 것이 좋습니다. 프라이머 디자인하는 프로그램이 많이 있어 이용하실 것 같은데 GC content 등을 이용한 단순한 계산값으로 실제로 실험을 해보지 않으면 알 수 없다고 생각합니다.
2. 증폭 size: size를 고려하여 제작합니다. 일반적인 PCR보다 real time PCR은 증폭 산물의 크기를 작게 (100 - 500bp) 디자인합니다. 이 부분에서 검증에 어려움이 있다고 생각합니다. 특이적인 증폭의 경우 gel에 로딩해서 one band를 확인할 수 있지만 size가 작아지면 구분하기 힘들 수도 있습니다.
3. GC content: Tm 값을 결정짓습니다. 50% 내외를 추천하고 있습니다.
상기 내용은 모두 계산적인 수치일 뿐 말씀하신 데로 모든 조건을 만족해도 심지어 논문에 나와있는 것들도 오류가 발생하는 것을 알 수 있습니다. PCR 방식의 차이 (taq man or cybergreen 등), 기계의 차이 (Roche or ABI 등), 증폭 방식 (Plate or tube)의 차이 등 너무 많은 변수가 있기에 많은 논문 serch 등을 통해 본인이 사용하는 PCR 환경에 맞게 이용하시라 참고 드립니다.
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답변
박애리님의 답변
2017-03-01- 2
학술문의 하게 되면 좀더 자세한 방법을 알려주긴 합니다만 ...
일단 프라이머를 통한 product size가 bps 가 200 을 넘지 않은 조건하에
프라이머를 후보 2~3가지 정도 design하여 PCR을 통해 증감여부를 간단히 확인한후
qPCR 하는 것이 아무래도 효율성이 좋은것 같습니다.
만약 qPCR에서 확신이 가지 않는다면
melting point 및 primer에대한 그래프가 측정되는 값을
데이터 분석을 통해서도 알수 있다고 합니다.
기계에 혹은 조건에 따라 변동사항이 있을수 있으니
쓰시는 조건을 잘 적어두었다가 학술문의 하시면 좀더 정확히 알수 있으실거 같아요 -
답변
김형택님의 답변
2017-03-14- 2
PCR을 통해 원하는 부위를 증폭하려면 적정한 primer 디자인은 필수입니다. 조금만 주의를 기울이신다면 충분히 원하는 결과를 얻을 것이라 생각됩니다.
1. primer의 디지인시에 3' sequence
3개 이상의 G나 C는 비특이적인 증폭을 할 수 있기때문에 피하는게 좋습니다.
그리고 마지막에 T 같은 경우는 다른 염기와 mispairing 할 수 있기때문에 피하는게 좋습니다.
2. self-complementary sequence가 있는지 확인하여야 합니다. 혹시나 Hairpin과 같은 구조를 형성하여 PCR이 안될수도 있습니다.
3. primer의 길이는 18~30 mer 정도가 적당하고 size는 100~500bps가 적당합니다.
4. GC %는 40~60% 가 적당합니다.
위에 답변과 겹치는 부분도 있는데 실험하시는데 도움이 되기를 바랍니다. -
답변
서준배님의 답변
2017-05-23- 1
각각의 프라이머가 다른 엑손, 혹은 junction에 있는 것이 좋습니다. 두개의 프라이머가 같은 엑손에 위치한 경우 지노믹 디엔에이와 구별이 힘듭니다.