2017-07-25
org.kosen.entty.User@411bcc05
신용원(begopa1)
- 5
동결건조를 통하여 스펀지 형태의 지지체를 제작하였습니다
세포부착과 세포독성 등을 확인하기 위하여 MTT assay 를 하려고 하는데요
궁금한게 몇개 있어 글을 남깁니다
----------------------------------------------------------------------------------
1) 세포 분주 방법
어떤 논문에는 지지체에 세포를 분주한 후 부착할 동안 4~6h 정도 기다린 후 그대로 배지를 첨가해서 키운다고 하고, 다른 논문에는 지지체에 세포를 분주 한 후 세포가 부착이 되면 다른 plate 로 옴겨서 (지지체에서 흘러나와 플레이트에 부착된 것을 배재하기 위하여) 측정한다고 나오는데요...앞의 방법 대로 키우고 MTT assay 만 지지체를 옴겨서 하면 안되는 것인지 궁금합니다...또 지지체에 cell을 seeding 하면 사실 얼마나 흘러나올지 예측이 안되는데...분주시 노하우나 주의할 점 좀 가르쳐 주세요
2) MTT assay
보통은 MTT solution 을 100ul (5mg/ml) 을 친다고 나오는데...지지체의 크기가 있다보니 100ul를 첨가해서는 지지체 중간부분 밖에 안찰꺼 같아서요 (지지체 크기는 5x5x3mm 이고 24 well plate 에서 키울 생각입니다). 이런 경우 MTT solution 을 세포가 주로 있는 위쪽 부분까지 잠기도록 첨가를 해야 하는건가요? 첨가한다면 농도를 그대로 하고 첨가해야 하나요??
고수님들 답변 부탁드립니다 ㅠ
세포부착과 세포독성 등을 확인하기 위하여 MTT assay 를 하려고 하는데요
궁금한게 몇개 있어 글을 남깁니다
----------------------------------------------------------------------------------
1) 세포 분주 방법
어떤 논문에는 지지체에 세포를 분주한 후 부착할 동안 4~6h 정도 기다린 후 그대로 배지를 첨가해서 키운다고 하고, 다른 논문에는 지지체에 세포를 분주 한 후 세포가 부착이 되면 다른 plate 로 옴겨서 (지지체에서 흘러나와 플레이트에 부착된 것을 배재하기 위하여) 측정한다고 나오는데요...앞의 방법 대로 키우고 MTT assay 만 지지체를 옴겨서 하면 안되는 것인지 궁금합니다...또 지지체에 cell을 seeding 하면 사실 얼마나 흘러나올지 예측이 안되는데...분주시 노하우나 주의할 점 좀 가르쳐 주세요
2) MTT assay
보통은 MTT solution 을 100ul (5mg/ml) 을 친다고 나오는데...지지체의 크기가 있다보니 100ul를 첨가해서는 지지체 중간부분 밖에 안찰꺼 같아서요 (지지체 크기는 5x5x3mm 이고 24 well plate 에서 키울 생각입니다). 이런 경우 MTT solution 을 세포가 주로 있는 위쪽 부분까지 잠기도록 첨가를 해야 하는건가요? 첨가한다면 농도를 그대로 하고 첨가해야 하나요??
고수님들 답변 부탁드립니다 ㅠ
- 지지체 scaffold
- cell seeding
- MTT
지식의 출발은 질문, 모든 지식의 완성은 답변!
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변 5
-
답변
이배훈님의 답변
2017-07-25- 2
1) 세포를 scaffold에 seeding 방법
Scaffold 에 세포를 seeding한 후 세포부착을 위해 4~6 h 기다렸다가 다른 flask에 옮긴후 배지를 첨가함. (기존 flask에 남은 세포를 카운팅 해서 cell loading efficacy 측정 (보통 60-90 %)
2) MTT assay--CCK-8 또는 alamarblue assays세포를 포함한 scaffold가 배지에 잠겨야 합니다. Scaffold를 새로운 flask에 옮겨(이전flask에 일부세포들이 scaffold에서 flask 바닥으로 이동(migration) 할 수 있습니다.) 보통 10% CCK 배지를 이용하여 1-3 h 정도 반응후 측정하면 됩니다.
이배훈(lbh217) 2017-07-25cell loading efficacy= scaffold 부착된 세포수/총 seeding 세포수 *100 (여기서 scaffold에 부착된 세포수=총 seeding 세포수-scaffold를 옮긴후 남아 있는 세포수)
-
답변
백아름님의 답변
2017-07-25- 1
1) 세포 분주 방법
답변에 앞서 일단 MTT assay의 목적이 궁금합니다.
세포를 지지체에 부착한 후 말 그대로 세포가 얼만큼 부착했는지를 알아보고자 하는 실험인지,
지지체에 부착한 세포가 지지체에 부착한 채로 얼만큼 잘 살아있는 것인지를 확인하는 실험인지 알고 싶습니다.
전자의 경우, 지지체에 세포를 분주한 후 세포가 부착이 되면 다른 plate로 지지체를 옮겨서 측정하는 것이 좋을 것 같고
후자의 경우, 지지체에 세포를 부착시킨 후 그대로 배지를 첨가해서 키운 다음 MTT assay 직전에 새로운 plate로 지지체를 옮겨서 측정하는 것이 좋을 것 같습니다.
이유는 세포 이동성 때문인데요,
세포마다 이동성을 가진 것도 있고 그렇지 않는 것도 있는데, 목적에 따라 이동성을 고려해야 할 것 같습니다.
지지체에 부착이 된 채로 잘 살아있는지 여부의 경우 지지체에 부착된 세포가 plate로 이동하는 것을 배제해야 하기 때문입니다.
2) MTT assay
MTT assay는 보통 96 well plate에서 진행하기 때문에 통상적으로 100 ul를 이용합니다.
따라서 well의 크기에 따라 MTT solution의 농도만 동일하게 유지하면 volume은 얼마든지 첨가해도 상관없는 것이죠.
지지체에 부착된 세포의 염색을 목적으로 하기때문에 당연히 24 well plate 내 지지체가 충분히 잠길정도의 solution을 첨가하여야 합니다.
도움이 되길 바라겠습니다. -
답변
김형택님의 답변
2017-08-01- 1
1) 세포 분주 방법
앞서 다른 분이 말씀하신 것처럼 MTT의 목적이 중요한것 같습니다. 말씀하신 의도를 살펴보면 지지체의 독성을 알아보시려고 하신건가요? 그러면 LIve/dead statining을 추천해드리고 싶습니다.
2) MTT assay
농도는 그대로 하고 충분히 잠길만큼 첨가하시면 됩니다. -
답변
이광호님의 답변
2017-09-28- 1
보통 96well 기준으로 100ul 일텐데요.
늘어난 용량에 비례해서
더 많은 양을 처리하셔야 합니다.
-
답변
최재원님의 답변
2017-09-29- 1
개발한 지지체의 경우 세포가 부착되는 경향성이나 부착률을 알고 싶어 할 것입니다.
이 경우 static seeding 혹은 dynamic seeding 크게 두가 정도로 접근이 가능할수 있습니다.
전자의 경우나 후자의 경우 지지체의 특성에 따라 다르게 적용될수 있기에 우서 지지체의 원료적 특성을 파악후 실제 적용시 어떤것이 좋은지 확인 하는 것도 좋습니다. 그래서 정확히 세포 부착력 시험에서 static seeding를 고집할 이유는 없습니다. 다만 어느 것이든 균일성을 가지는 방법으로 적용하는 것이 분석에 도움이 될것 입니다. 또한 세포 접종률은 총 접종 세포수를 기준으로 부착률되고 남은 세포를 계수(수동 혹은 자동 계수기등)하여 %로 환산하는 방법도 있을 것입니다.
-MTT-
지지체에 세포 부착, 접종 정도 혹은 더 나아가 세포 독서을 MTT를 사용하여 경우가 많은 것입니다. 과거 MTT 계열의 시약을 지지체에 처리 하게 될 경우 흡습성이 특성이나 그외 화학적 특성으로 지지체에 결합하는 경우가 있을수 있습니다. 이 경우 과연 모두 획득할수 있을 것이냐? 그렇다면 여기서 측정된 값은 정확한 결과값이라 여겨 질수 있느냐 등의 문제로 논의를 많이 진행했었습니다. 따라서 일반 세포에서 MTT 결과값을 얻는것과 달리 지지체에서 MTT를 직접 처리하여 얻는 시험은 매우 정교하고 신중하게 시행해야하며, 대조군과 비교시 동일하게 MTT 용출물을 수득 할수 있어야 할 것입니다.
즉 지지체의 세포 독성 시험에서 MTT의 이해와 적용가능성을 모두 고려해보아야 하는 부분입니다. 일반 배양접시를 이용한 MTT 세포독성시험법이 있다고 지지체에 그대로 적용할지를 고민해봐야 할것입니다.
Cell loading efficacy를 기존 well에 남은 세포를 카운팅 하는 줄 몰랐네요!
배워갑니다~