2017-08-16
org.kosen.entty.User@5f237eef
신용원(begopa1)
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동결건조로 스펀지를 제작하여 그 위에서 세포를 키우고
세포의 부착모습을 전자현미경으로 찍으려고 하는데요
논문대로 2.5% glutaraldehyde 에서 30분 100% 에서 50% alcohol 을 이용하여
고정 후 탈수 과정을 거쳤는데 탈수 후 air dry 과정에서 sponge 가 형태를 잃어버리고
다 쪼그라 드네요....
혹시 경험 있으신분들 조언부탁드립니다 ㅠ
세포의 부착모습을 전자현미경으로 찍으려고 하는데요
논문대로 2.5% glutaraldehyde 에서 30분 100% 에서 50% alcohol 을 이용하여
고정 후 탈수 과정을 거쳤는데 탈수 후 air dry 과정에서 sponge 가 형태를 잃어버리고
다 쪼그라 드네요....
혹시 경험 있으신분들 조언부탁드립니다 ㅠ
- sponge
- dehydration
- glutaraldehyde
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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답변
조윤환님의 답변
2017-08-17- 1
세포 키우는 작업과는 무관한 사람이나 전체적인 과정을 보고 제 나름의 추정을 말씀드려 봅니다.
스펀지를 만들고 glutaraldehyde과 alcohol처리를 순차적으로 하는 과정으로 봤을 때 air drying을 하면 당연히 변형이 올 것 같습니다.
아마 glutaraldehyde 처리를 하는 것은 고정 작업을 하는 것이고, alcohol 처리를 하는 것은 남아 있는 수분을 제거하는 과정으로 보입니다. 문제는 알코올처리 과정에 있다고 보입니다.
탈수를 위한 알코올 처리는 님처럼 100 --> 50이 아니라 50 --> 100으로 하셔야 합니다. 단계적으로 알코올함량을 높이면서 해야 순차적으로 조직내에 수분이 알코올로 대체되면서 결국 나중에 100알코올로 처리할 때 수분이 완전히 제거되고, 형태의 변형도 오지 않을 겁니다.
단번에 100% 알코올로 처리하면 아무래도 변형이 순간적으로 올 것이고, 후에 수분이 더 많은 50% 알코올로 처리를 하면 수분을 추가하는 꼴이 되죠. 때문에 공기중에서 건조를 하면 수분이 날라가면서 변형이 올겁니다. 단계적으로 천천히 하는게 키포인트인듯 합니다.
더불어 요즘처럼 습도가 높은 상태에서 공기중에서 건조를 했다면 변형 가능성이 더 높아졌을 듯 합니다. 알코올 처리 후에 동결건조를 하셨다면 좀 더 안정적이지 않았을까 생각합니다.
조윤환(brmdolee) 2017-08-18아 스펀지에 세포가 붙어 있는 상태입니까? 몰랐네요. 마지막 동결건조는 안되겠군요. 탈수에 사용하는 알코올은 보통 에탄올인데 어떤 것을 사용하셨나요? 에탄올은 물과 95:5 비율의 Azotrope 라는 혼합물을 형성하는 성질이 있습니다. 때문에 100% 에탄올을 공기 중에 두면 자연스럽게 수분을 흡수하여 95% 에탄올이 됩니다. 님이 사용하신 탈수방법은 이러한 에탄올의 성질을 이용한 것으로
보입니다. 순차적으로 농도를 올리는 것은 아마도 변형을 막기 위한 것으로 보이는데, 이 과정에서 탈수가 충분치 않으면 스펀지가 건조과정에서 변형이 오게될 겁니다. 이런 부분을 생각하셔서 해보시기 바랍니다. -
답변
이배훈님의 답변
2017-08-21- 1
스폰지의 stiffness에 따라 건조과정에서 수축정도가 달라집니다.
2.5% glutaraldehyde로 처리하고 물로 세척후 에탄올 탈수를 거치지 않고
동결건조를 해도 가능하니다. 다만 전미현미경 샘플 처리시(진공) 샘플이 수축될 것입니다.
부드러운 스폰지의 경우 외형의 변형/수축을 감안해야합니다.
(이런 수축을 조금 피할 수 있는 길은 스폰지를 제작시 stiff하게 만들어야 합니다.)
아 죄송합니다 본문에 반대로 썼네요...50-100% 로 알콜% 를 올려가면서 탈수과정을 진행하였습니다..알콜 처리 후 동결건조 과정을 말씀하셨는데...그럼 지지체를 알콜처리 한 후 냉동시킨 다음에 동결건조를 하라는 말씀이신가요? 제가 원하는 이미지는 지지체에 세포가 붙어있는 모습이라서요...혹시 동결건조 과정에서 세포가 깨지거나 하지 않을까 궁금합니다