2017-10-24
org.kosen.entty.User@19e59aac
박애리(shara0421)
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250~300kDa 사이즈인 protein을 보고 싶은데 7.5% gel에서도 잘보이는지 궁금합니다
만약 아니라면 6%gel을 써야하는데 transfer 조건을 어떻게 쓰시는지 ....
(7.5%gel 에서의 transfer 조건으로 하면 안될거 같아서 ;;)
그리고 band lane이 끌리듯이 나와서 background 너무 튀게 나와서 blocking 시간도 늘려봤는데
소용이 없더라구요 혹시 샘플의 purity가 걱정이 되기도 하는데 혹시 이럴땐 어떻게 하시는지 노하우 있으시면 공유 부탁드립니다.
만약 아니라면 6%gel을 써야하는데 transfer 조건을 어떻게 쓰시는지 ....
(7.5%gel 에서의 transfer 조건으로 하면 안될거 같아서 ;;)
그리고 band lane이 끌리듯이 나와서 background 너무 튀게 나와서 blocking 시간도 늘려봤는데
소용이 없더라구요 혹시 샘플의 purity가 걱정이 되기도 하는데 혹시 이럴땐 어떻게 하시는지 노하우 있으시면 공유 부탁드립니다.
- western blot
- troubleshooting
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 5
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답변
장성재님의 답변
2017-10-24- 1
잘 아시다시피 단백질 사이즈가 250~300 kDa 정도면 7.5%에서도 잘 나옵니다.
4-12 (4-15)% gradient gel을 사용해보시는 것도 좋습니다.
전기영동에 사용하신 시료가 정제한 단일 단백질 시료 인가요?
그런데 결국 목적은 western blot 이신 것 같군요.
밴드가 끌리듯이 나온다고 하셨는데, 혹시 단백질이 당 수식 또는 유비퀴틴 등으로 수식이 많이 되었거나 dimer 이상의 multimer를 형성하는 것이라면 그럴 수도 있습니다.
Blocking의 문제는 아닙니다.
어떤 단백질이죠??
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답변
장성재님의 답변
2017-10-24- 1
사용하시는 것이 어떤 회사 제품인지는 모르겠지만,
Cell Signaling Tech.의 anti-Phospho-mTOR (Ser2448) Ab의 예를 보니 밴드가 잘 나올 것 같은데....
1. transfer 조건(buffer, 전압, 시간 등)을 확인하시고
2. transfer 후 Ponseau S로 transfer 확인
3. 샘플의 상태(오래된 것??) 확인
4. 항체의 성능 검증 후 신규 구입
5. 유사 실험 논문을 참고
등으로 조언 드릴 수 있겠네요.
선임자의 연구노트를 가지고 재현 실험을 하시는 것 같은데....
화이팅 하십시오. -
답변
박애리님의 답변
2017-10-24- 1
말씀해주신 조언들은 모두 찾아 보았고 확인했었습니다(4번을 제외하고서) 선임자의 재현실험도 아니고 연구실에서 쓰던 조건들이 맞는 것인지 노트를 확인해본거였고, 단지 연구실에 오래된 안티바디로 결과가 안나오는 건지 나오는건지 확인해보고자 질문드렸습니다. 아마 4번의 가능성이 제일 높은거 같아 이부분을 참고해보겠습니다. 감사합니다. -
답변
강경돈님의 답변
2017-10-31- 1
6%나 7.5% gel의 transfer 조건은 다르지 않습니다.
다만 타겟 단백질의 사이즈가 크니 overnight trnasfer를 고려하셔도 좋을것 같구요.
Phospho form에는 BSA blocking이 좋습니다. 그리고 시료를 준비하신 후 얼리지 마시고 바로 사용하시면 좀 더 깨끗한 밴드를 얻으실 수 있으실껍니다.
혹시 더 궁금한 내용이 있으시면 연락주십시요. -
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표종옥님의 답변
2017-12-29- 1
7.5 에서도 잘 보일겁니다. 다만 좀 천천히 내리시고. transfer 할 때 methanol 안 쓰심 좋구요.
blot 이 지저분하면 쓰다 남은 FBS나 BSA 에 희석해서 쓰시면 background 가 확연히 줄어듭니다.
현재 하시려는 mTor 류가..좀 잡기 힘들기도 합니다.
mTOR phosphoform입니다. 연구실에 선행연구 하셨던 연구노트들 참고해보니 western film으로는 잘 나와보이는데 제거는 clear하지 않게 나와요 antibody가 오래되서 exposure할 때 background도 같이 올라와 보이는건지도 생각해보게 되더라구요