2017-11-11
org.kosen.entty.User@3f7dbc8d
박선욱(glad8888)
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안녕하세요
줄기세포관련 공부를 하다가 궁금한게 생겨 글을 씁니다.
줄기세포를 배양하다보면 그것이 100 % 다 줄기세포가 아닌데
colony forming assay 를 하여도 씨딩 세포수에 비하여 몇 %만 콜로니를 형성합니다.
또한 줄기세포 확인 방법인 팩스를 통한 CD마커나 PCR을 통한 단백질 발현, 분화 하는 방법들이 있는데 이것은 줄기세포가 있는지 없는지 확인실험이라 생각하고 순도를 확인하는 방법이 아니라고 생각합니다.
줄기세포의 순도를 확인하는 방법에는 어떠한것들이 있을까요?
- 줄기세포
- 순도
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 7
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답변
강경돈님의 답변
2017-11-11- 2
순도를 확인하는 방법은 여러가지가 있을 수 있겠습니다만 stem cell biomarker를 사용하여 flow cytometry로 확인하는 방법이 가장 쉽고 정확할 것 같습니다. 그리고 FACS를 이용하여 positive 세포들만 sorting하여 배양하면 됩니다.
다른 방법은 찾아보니 다음과 같은 논문이 검색되네요. 참고바랍니다.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27400794
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답변
김동수님의 답변
2017-11-13- 2
FACS로 하시면 순도확인실험이 됩니다. 정 미더우시면 생각하신는 마커를 사용하여 negative selection을 해보시는것 또한 궁금증해소에 도움이 되지 않을까요? Curiosity는 님이 전문성 발전에 큰 기반이 될것입니다~^. -
답변
서기원님의 답변
2017-11-17- 2
다른 답변하신 분들처럼, 세포 순도 확인은 Flow cytometry 방법이 제일 일반적인고 쉬운 방법입니다. Flowcytometry에 대한 정확한 이해가 있으신지 모르겠으나, 본 기법은 말씀 하신 것처럼 발현하는 단백질의 유뮤나 세포의 존재 확인만을 위해서 사용하지는 않습니다.
분석하는 샘플내의 모든 세포를 검출하고, 원하는 조건에 맞는 세포를 1개 단위로 counting하는 기술입니다. 또한 그 세포의 물리적/화학적 특성의 강도도 구분하여 표기하는 결과를 도출해주는 장비입니다. 따서서 전체 세포중에 연구자가 특정한 세포의 빈도를 계산할 수 있습니다. 곧 순도라고 할 수 있겠죠.
모양이나 크기로도 분류 할 수 있으며, 전체 cell population에서 특정 단백질 발현하는 세포의 비율(말씀하신 순도 개념으로 생각할 수 있는), 그리고 각 세포의 발현 단백질의 intencity 등이 확인 가능합니다.
검출법이 대부분 항체 기반이기 때문에 사용하는 항체의 단백질에 대한 secificity, 그리고 검출하고자 하는 세포를 잘 chaterization 할 수 있는 마커의 선별이 중요합니다.
한개의 마커로 분석이 용이하지 않을 경우, 2개 이상의 항체를 사용하기도 합니다. (예- double positive selection)
1차로 원하는 세포군을 사이즈, 모양, 특이 항체등을 이용하여 선별하고(원하는 세포의 수를 늘이거나 배제, 혼선을 주는 세포의 negative selection 등 으로 생각할 수 있음), 이들만을 gating 한 후 특이 마커 항체를 이용하여 counting 합니다. 이것들을 필요에 따라 여러번 할 수 있구요. 요즘 장비들을 파장의 resolution이 좋아져서 10개 이상의 형광도 구분하는 장비들이 판매됩니다.
예) 면역세포(splenocyte whole cell) > lympocyte 만 분리 (크기, 모양) > CD3, CD4 double positive cell 분리 혹은 CD8, IFNr double positive cell 분리
단지 목적이 빈도나 발현 확인이 아니라, 특정 세포만을 분리하여 사용한다면, sorting하여 다시 배양하기도 하고요.
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답변
김형택님의 답변
2017-11-17- 1
저도 같은 의견입니다. FACS로 확인을 하고 필요한 줄기세포는 sorting을 하는 것이 가장 손쉬운 방법입니다. -
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김양희님의 답변
2017-12-06- 1
줄기세포 마커들을 이용해서 FACS로 순도 확인 가능합니다. 논문 많이 있으니 관련 줄기세포 FACS 마커 확인해서 FACS 돌리시면 됩니다. -
답변
조수호님의 답변
2017-12-18- 1
고순도로 줄기세포를 질문자님께서 얻을 수 있는 방법을 아시는 것이 도움이 될 듯하여 올려드려요. SCM생명과학에서 개발한 층분리배양법은 기존의 분리배양 방법에 비해 적은 양의 골수에서 단일세포유래 성체줄기세포군을 대량으로 추출할 수 있는 기술입니다. 현재는 이 기술로 이식편대숙주질환용 줄기세포치료제가 국내에서 임상 2상을 진행 중이라고 하니 기술적으로 보증이 되어있다고 봅니다. 연구하시면서 참고하세요. -
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조준석님의 답변
2018-01-27- 1
좀 늦은 답변입니다만 cell 이 너무 적어서 FACS할 만한 상황이 안 되면 컬쳐하실때 세포 밑에 슬라이드를 놓아서 immunocytochemistry를 하는것도 방법입니다.