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1. 산소-포도당 결핍 - 재산소화 실험에서 glucose 없는 DMEM culture media를 hypoxia chamber 에서 유지 (4~6시간)
2. hypoxia condition media로 hypoxia chamber에 2시간 정도 배양
3. complete media로 normal chamber로 1시간 배양 후 실험
위 실험 방법은 jove. com 에 게재된 방법을 참고하여 계획한 실험(https://www.jove.com/video/52699/oxygen-glucose-deprivation-reoxygenation-as-an-vitro-ischemia )
위에 JOVE에서는 hypoxia chamber with 95%, N2 and 5% CO2 for 2 h at 37 °C 조건하에 O2 level을 조절하여 실험하였고, 저는 가지고 있는 hypoxia chamber (BD GasPak™ EZ container systems + GasPak™ anaerobic and CO2 indicators) 를 이용해서 O2 level을 5~10% 정도로 조절할 계획입니다. MCAO 모델에서 중요한것이 O2 level이라면 JOVE에서 조절한 N2 level이 없더라도 BD system을 이용해 O2 level을 낮춰 세포상태에서 MCAO 유발 모델이라고 할수 있는지 궁금합니다. 관련 실험을 해 보셨거나 정보를 아시는 분은 답변 부탁드립니다.
- MACO
- HYPOXIA
- Oxygen and Glucose deprivation
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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장성재님의 답변
2017-12-27- 2
anaerobic chamber로는 ischemia-reperfusion 모델 실험하시지 어려울 것 같습니다.
저는 10여년 전에 CO2 incubator에 N2+CO2 혼합가스를 사용했었습니다.
상용화된 hypoxia chamber도 있습니다만, 여건이 안되시다면 차라리 첨부한 논문을 참고하셔서 자체 제작하시는 편이 좋을 듯 싶습니다.
장성재(sjsjj) 2017-12-27실험 후 CO2 분압만 재조정 후 다시 동물세포 배양기로 사용이 가능합니다만...
일단 원하시는 ischemia-reperfusion 실험을 연속해서 하려면 인큐베이터는 2대가 필요하지 않을까요?
인큐베이터가 1대 뿐이시라면 첨부해드린 논문에서와 같이 저렴하게 제작하시는 것도 좋을 듯....
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박애리님의 답변
2017-12-27- 2
hypoxia 조건의 실험을 꾸준히 하실계획이면 인큐베이터를 사는 것을 추천합니다.
유지하는 비용 및 관리하는 것이 까다롭지만 그방법이 가장 실험하기 좋은 조건이지 않나 싶습니다.
그런데 산소를 감지하는 센서가 비용이 일년에 한번씩 교체해줘야해서 몇백씩 매년 유지비로 나가는 비용 때문에 일시적인 실험에서는 적합하지 않아서 챔버를 이용해서 실험을 했는데 역시나 산소 농도를 감지하는 센서는 비싸서 가스회사에 주문 하여 혼합가스를 이용하였습니다.
다행히도 가스회사에 문의 하면 원하는 산소농도대로 조절하여 질소와 혼합가스로 만들어주기 때문에 그 혼합가스로 챔버에 가스 주입해서 실험했었던 기억이나네요 -
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강경돈님의 답변
2017-12-28- 2
저희 랩에선 인큐베이터 중 하나를 hypoxia (CO2 5%, O2 1%) 조건으로 고정해 사용 중입니다.
지속적으로 hypoxia 실험을 하신다면 저도 구입하시는 것이 좋다고 생각합니다.
유지하는 데 어려운 점은 없습니다.
성경주(skj) 2018-01-11일반적으로 세포실험에 사용하는 CO2 incubator는 가스통에서 연결하는 호스가 1개 일텐데 혼합가스를그 호스를 통해 연결해서 사용한다는 말인가요? 그렇다면 N2의 유입해 따른 O2 양은 어떻게 측정을 해서 실험을 진행하시는지요? 인큐베이터에 표시되는 것은 CO2 %만 나올건데요~
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김형택님의 답변
2018-01-09- 2
제가 알고 있는 hypoxia chamber의 경우, 가스 배출 펌프가 존재하고 여기에 인위적으로 N2가스를 채워서 O2 level을 낮춰주는 시스템으로 알고 있습니다.
(개인적인 의견으로는, N2를 사용해서, chamber 내 gas ratio를 빠르게 바꿔주려고 한것 같습니다.)
N2 가스의 사용여부에 따라서 hypoxic model을 결정할 수 있는 건지는 잘 모르겠습니다.
실험의 핵심은 chamber내에 있는 O2 sensor에 의한 chamber 내 O2 level 이 중요할 것 같습니다.
실험을 진행하시다가, 최대한 문제를 적게 하려면, 많은 논문들이 대부분 N2를 사용하므로 N2를 사용하시는게 답인것 같습니다. 그리고 장기간으로 실험을 진행하실거면 구입을 해보시는 것이 어떨까요?
도움이 됐는지 모르겠습니다.
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심우영님의 답변
2018-01-22- 1
"N2 level이 없더라도 BD system을 이용해 O2 level을 낮춰 세포상태에서 MCAO 유발 모델이라고 할수 있는지 궁금합니다"라고 하셨는데 O2의 농도만으로 hypoxy상태를 판단합니다.N2는 없어진 O2를 대체하기 위해서 넣는 것입니다. (대기중에 80%가까이 있으니..)
O2만 통제하여 만드는 모델도 MCAO롤 인정해 줍니다.
95%, N2 and 5% CO2 혼합가스를 인큐베이터에 주입하고 다시 CO2를 주입해서 실험을 한다면 CO2 주입 후에는 다른 세포들을 키우는데도 문제가 없는지..아니면 인큐베이터 자체를 ischemia-reperfusion 모델로만 사용해야 하는지 여쭤봅니다