2018-06-06
org.kosen.entty.User@1b4b2f07
김주동(syncn310)
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stereotaxin을 이용하여 mouse brain에 AAV를 injection하는 실험에 관하여 궁금한 점이 있어 질문 드립니다.
약 6weeks mouse를 사용하여 dorsal striatum에 AAV5-GFP를 1ul injection하였습니다. 그리고 1달 후 mouse brain을 perfusion 및 fixation하여 형광현미경으로 해당 부위를 확인하였지만 GFP의 발현을 확인하지 못하였습니다. 혹시 stereotaxin을 이용하여 이와 같거나 비슷한 실험을 하신 분이 계시다면 조언 부탁드리겠습니다. 제가 실험을 진행한 STEP을 적어보겠습니다.
1. AAV5-GFP 1ul를 mouse dorsal stritum에 injection 하였습니다.
2. 1달 후, brain perfusion (PBS) 및 fixation (4% paraformaldehyde)을 진행하였습니다.
3. mouse brain을 4% paraformaldehyde에 넣고 다음 날 30% sucrose에 다시 옮겨 담았습니다.
4. 다음 날 brain이 가라 앉을 것을 확인 후 brain section을 진행하였습니다.
많은 조언 부탁드리겠습니다. 감사합니다~
약 6weeks mouse를 사용하여 dorsal striatum에 AAV5-GFP를 1ul injection하였습니다. 그리고 1달 후 mouse brain을 perfusion 및 fixation하여 형광현미경으로 해당 부위를 확인하였지만 GFP의 발현을 확인하지 못하였습니다. 혹시 stereotaxin을 이용하여 이와 같거나 비슷한 실험을 하신 분이 계시다면 조언 부탁드리겠습니다. 제가 실험을 진행한 STEP을 적어보겠습니다.
1. AAV5-GFP 1ul를 mouse dorsal stritum에 injection 하였습니다.
2. 1달 후, brain perfusion (PBS) 및 fixation (4% paraformaldehyde)을 진행하였습니다.
3. mouse brain을 4% paraformaldehyde에 넣고 다음 날 30% sucrose에 다시 옮겨 담았습니다.
4. 다음 날 brain이 가라 앉을 것을 확인 후 brain section을 진행하였습니다.
많은 조언 부탁드리겠습니다. 감사합니다~
- AAV
- stereotaxic injection
- brain
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변 2
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답변
김형택님의 답변
2018-07-11- 1
앞서 다른분이 조언을 많이 주셨는데요.
1. AAV5-GFP의 발현여부를 확인을 하셨는지요?
2. 1ul라는 정보만 있는데 Virus의 MOI를 어떻게 하셨는지요?
2. 가지고 계신 GFP가 한달동안 발현하는 것은 확인되었는지요?
3. 시간을 짧게 진행해도 brain내에 바이러스의 infection여부는 확인하셨는지요?
4. 현재 샘플에서 데이터를 살릴 수 있는 방법은 GFP Antibody로 염색을 하여 Virus가 제대로
작용하는지 확인을 해보는 것이 최선일 것 같습니다.
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답변
박진성님의 답변
2018-06-14- 0
1. AAV5-GFP가 1ul라고 되어있는데, 농도별로 주입해보셨는지요?
2. 가지고 계신 GFP가 한달동안 발현하는 것은 확인되었는지요?
3. 한달동안 두지말고, injection 직후, 1일후, 3일후.. 먼저 제대로 들어가서 발현하는지 확인하는 작업이 필요해보입니다. (양/기간 조절)
4. fix후 확인하면 형광이 죽기 때문에 frozen section 권장드립니다. (작두를 이용해서 sacrifice)
5. frozen section이 힘들경우 GFP antibody를 이용해서 IHC로 확인하는 방법도 있습니다.