2018-08-08
org.kosen.entty.User@49287fb8
장미옥(bestwife76)
- 6
특정 스트레스 처리를 통해 그 조건에서 발현하는 transcription factors를 중심으로 그와 관련된 유전자들의 발현패턴을 확인하고자 합니다
즉, RNA sequencing을 하고 싶은거죠
초기 material이 제게 있으면 얼마나 좋을까요..
안타깝게도
초기 material을 해외에서 가져와야 하는 상황이고요
해외에서는 500L fermentor에서 키우고 있다고 하네요 당연히 액상이죠...
여기서 문제가 발생됩니다
RNA를 추출해야 하는데요
1. 초기 material을 액상으로 50ml tube 같은데에 30ml 정도 담아서
해외 배송을 해 달라고 한 후에
제가 여기서 작은 플라스크로 키워서 스트레스를 처리할까요?
이렇게 해도 500L에서 스트레스를 준 것과 같은
RNA 발현 패턴을 볼 수 있을까요?
(배양 용기가 달라져서 cells 이 감지하는 스트레스가 다를까봐
이렇게 해도 원래의 RNA 발현 패턴을 확인할 수 있는 건지 모르겠습니다)
2. 500L에서 스트레스를 줘서
cells를 샘플링 한 후 RNA 를 고순도로 추출해 달라고 할까요?
추출한 것을
작은 액체 질소통에 담아서 해외 배송을 해달라고 할까요?
액체 질소가 해외 배송이 되는지를 일단 잘 알지 못하고 있습니다
3. 500L에서 스트레스를 준 후
cells를 샘플링, 동결 건조를 하는 거죠
그리고 동결 건조된 cells만을 해외 배송해 달라고 하는 거죠
RNA를 추출하기 위해 동결 건조를 해 본 적이 없어서
이게 가능한지 모르겠습니다
이도 저도 못하고 있는데
이 문제를 어떻게 해결해야 할까요?
또 다른 해결 방법이 있다면 좋겠습니다
아시는 분 답변 부탁드립니다
즉, RNA sequencing을 하고 싶은거죠
초기 material이 제게 있으면 얼마나 좋을까요..
안타깝게도
초기 material을 해외에서 가져와야 하는 상황이고요
해외에서는 500L fermentor에서 키우고 있다고 하네요 당연히 액상이죠...
여기서 문제가 발생됩니다
RNA를 추출해야 하는데요
1. 초기 material을 액상으로 50ml tube 같은데에 30ml 정도 담아서
해외 배송을 해 달라고 한 후에
제가 여기서 작은 플라스크로 키워서 스트레스를 처리할까요?
이렇게 해도 500L에서 스트레스를 준 것과 같은
RNA 발현 패턴을 볼 수 있을까요?
(배양 용기가 달라져서 cells 이 감지하는 스트레스가 다를까봐
이렇게 해도 원래의 RNA 발현 패턴을 확인할 수 있는 건지 모르겠습니다)
2. 500L에서 스트레스를 줘서
cells를 샘플링 한 후 RNA 를 고순도로 추출해 달라고 할까요?
추출한 것을
작은 액체 질소통에 담아서 해외 배송을 해달라고 할까요?
액체 질소가 해외 배송이 되는지를 일단 잘 알지 못하고 있습니다
3. 500L에서 스트레스를 준 후
cells를 샘플링, 동결 건조를 하는 거죠
그리고 동결 건조된 cells만을 해외 배송해 달라고 하는 거죠
RNA를 추출하기 위해 동결 건조를 해 본 적이 없어서
이게 가능한지 모르겠습니다
이도 저도 못하고 있는데
이 문제를 어떻게 해결해야 할까요?
또 다른 해결 방법이 있다면 좋겠습니다
아시는 분 답변 부탁드립니다
- transcriptome
- RNA 샘플 해외 이송
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 6
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답변
서기원님의 답변
2018-08-08- 3
RNA 분석 전문가는 아니지만, 한말씀 드리면,
1. 번 과정은 매우 다른 결과를 초래할 가능성이 커 보입니다. 500L와 30mL은 배양 조건이 너무 다름니다. 배양 전공자가 본다면 깜짝 놀랄 일입니다. 일일이 설명드리지는 않겠습니다만, 다른 배양 조건에서 세포는 당연히 다른 반응을 보입니다. 다른 세포 반응에서라면 RNA 발현 패턴도 달라지겠죠. 어떤 RNA를 타깃으로 하는지믄 모르겠지만, 상당부분의 RNA 발현 양상이 변할 것으로 추측 됩니다.
3. 번 세포 동결 건조 역시 그 과정 중에 RNA의 발현 패턴이 변할 가능성이 커 보입니다. 해당 방법은 주로 단백질의 보존을 위해 하는 방법입니다.
2. 이 말씀하신 것중에는 그 나마 제일 영향이 적을 것으로 보입니다.
추출된 RNA를 냉동 상태로 받는다.( RNA는 RNase에 취약할 뿐 다른 조건에서는 생각보다 안정한 물질입니다.) 분리과정에 RNase 오염 없이 순수 분리 정제를 잘 한다면 문제가 없어 보입니다.
기타로 의견으로,
1) 해외에서 배양한 세포를 급속 냉동하고 -70 이하로 냉동상태로 받는다. (받은 세포로부터 직접 RNA 분리하여 사용)
2) 해외에서 진행하는 500L 배양조건과 완벽히 동일하게 배양을 실시하여 샘플을 얻는다.(해당 방법은 현실적으로는 불가능할 것으로 보임니다만)
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답변
임창임님의 답변
2018-08-09- 2
저도 개인적으로 2번이 적절할 것으로 사료됩니다.
해외 배송 중 RNA quality가 걱정이 된다면
저는 cell을 RNA lysis buffer에 넣어서 dry ice로 배송받는 게 어떨까 생각합니다.
RNA 분리 과정 초기에서 사용하는 lysis buffer에 cell을 녹여서 얼려 배송한 후
국내에서 분리하는 것입니다.
transcriptome은 대조군과 스트레스군을 비교 분석하는 것이기에 대조군만 포함이 된다면 분석에 큰 무리는 없을 것으로 생각합니다.
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답변
김형택님의 답변
2018-08-09- 1
지금 실험을 진행하시기 위해 초기 material이 없다고 하셨는데, 결국은 앞으로의 실험 진행과 RNA를 얻더라도 예상했던 결과와 다른 부분이 있을 수 있기 때문에 이러한 영향 때문에 랩에 새롭게 setting을 하실 필요가 있지 않나 생각됩니다.
세포를 다운 시켜서 얼린 다음에 드라이아이스 형태로 받아서 RNA는 국내에서 Prep을 하고 sequencing 의뢰하여 분석하고, 그동안에 새롭게 구한 material로 setting을 하시는 건 어떨까요?
장미옥(bestwife76) 2018-08-13실험실에 세팅 이야기가 한 두번 나온게 아니었죠... 그 때마다 어렵다 여서 지금은 어떻게 받아들일지요... 그래도 필요하면 도전해야죠 될 때 까지... 감사합니다..
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답변
황규찬님의 답변
2018-09-04- 1
** Total RNA를 RT한 후, freezing dry한후 실온에서 전달 받은후 다시 TE 등으로 녹여 분석함이 좋을 듯합니다.
장미옥(bestwife76) 2018-09-05네
해외 시료 보유 기관에 분자생물학적 기법을 다룰 수 있는 기자재 내지는 시스템이 전혀 없다 합니다
이런 상황에서는 어떻게 해야 할까요? -
답변
심우영님의 답변
2018-09-13- 1
RNAlater라는 시약이 있습니다.
제 생각으로는 세포를 샘플링하여 RNAlater에 담가서 드라이 아이스와 함께 얼려서 배송하면 문제없을 듯 합니다.
*참고로 위에 RNA lysis buffer라 하면 Trizol이 될듯 한데, 포장이 뜯긴 tube에 넣으면 위험물로 분류되어 반입이 안될 수도 있으니 알아보시고 진행하시는 것이 좋을 듯 합니다. -
답변
서준배님의 답변
2018-12-03- 0
Cell에서 RNA를 한번 추출하면 degradation은 피할 수 없을 겁니다.
그래서 장기간 샘플을 보관할때는 @ggito0731님이 설명하신 대로 RNAlater에 넣어서 overnight 정도 보관한 다음 RNAlater를 제거 하고 건조된 샘플을 질소 액체에 급냉을 한 다음 드라이 아이스를 충분히 넣은 다음 보내시면 될 것 같습니다.
어떤 연구든 마찬가지겠지만 한걸음 한걸음 갈 때마다 문제들을 만나게 되네요
잘 알지 못하는 부분이 거의 대부분이라서 어려울 때도 참 많은데,
도움 주셔서 감사합니다