2019-01-21
org.kosen.entty.User@27fe0dea
서기원(majimotai)
- 5
안녕하세요..
PCR 후 전기 영동을 하였는데, DNA인지 junk인지는 모르겠으나 well 에 상당량의 잔량 염색(EtBr)이 발생합니다.
일을 하면서 가끔 생기는 현상이라 무시하고 그냥 지나치곤 하였는데, 이번 실험은 무시하고 지나칠 상황이 못되고 또, 이참에 원인과 해결책을 모색하고자 싶어 여쭙게 되었습니다.
well에 상기와 같은 현상이 발생하는 원인 및 이의 해결책에 대해서 어떤 내용이던 조언을 주시면 많은 도움이 될것 같습니다.
PCR 조건(결과 분석에 필요하실 정보만 기입하겠습니다. 추가 정보가 필요하시면 말씀 주십시요.)
1. Template - linearized DNA (PCR product) or plasmid (각기 다른 실험에서 2조건 모두에서 같은 현상 발생)
2. product size - 17kb
3. Enzy - Takara GXL pol
4. Template 농도 - 10ng
5. Template gene > virus 유전 정보
전기 영동
1. 1% gel (sigma a6877) > Medium EEO
2. 100v 30min 영동 (TAE)
3. PCR product 전기 영동에 사용
4. 6X dye(일반 dye without SDS)
5. 전기영동 농도(0.5~1ug running)
0.5% gel, 200ng 수준에서 전기 영동 하였으나 동일 현상입니다.
초보적인 질문일지 모르겠습니다.
관심과 답변 미리 감사드립니다.
PCR 후 전기 영동을 하였는데, DNA인지 junk인지는 모르겠으나 well 에 상당량의 잔량 염색(EtBr)이 발생합니다.
일을 하면서 가끔 생기는 현상이라 무시하고 그냥 지나치곤 하였는데, 이번 실험은 무시하고 지나칠 상황이 못되고 또, 이참에 원인과 해결책을 모색하고자 싶어 여쭙게 되었습니다.
well에 상기와 같은 현상이 발생하는 원인 및 이의 해결책에 대해서 어떤 내용이던 조언을 주시면 많은 도움이 될것 같습니다.
PCR 조건(결과 분석에 필요하실 정보만 기입하겠습니다. 추가 정보가 필요하시면 말씀 주십시요.)
1. Template - linearized DNA (PCR product) or plasmid (각기 다른 실험에서 2조건 모두에서 같은 현상 발생)
2. product size - 17kb
3. Enzy - Takara GXL pol
4. Template 농도 - 10ng
5. Template gene > virus 유전 정보
전기 영동
1. 1% gel (sigma a6877) > Medium EEO
2. 100v 30min 영동 (TAE)
3. PCR product 전기 영동에 사용
4. 6X dye(일반 dye without SDS)
5. 전기영동 농도(0.5~1ug running)
0.5% gel, 200ng 수준에서 전기 영동 하였으나 동일 현상입니다.
초보적인 질문일지 모르겠습니다.
관심과 답변 미리 감사드립니다.
- PCR
- DNA
- 전기 영동
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 5
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답변
변경필님의 답변
2019-01-22- 3
junk 일 수도 있고 아닐 수도 있습니다.
해당 문제 발생시 고려 사항을 간략하게 기술 해 보았습니다.
1. Template 문제
가. template에 대한 농도 오류
나. template gene prep 상 오류
다. prep 후 보관상 문제로 template gene 변형
2. Primer 문제
가. 비특이적 binding으로 인한 큰 size의 PCR 산물 생성
3. 제조한 agarose 문제
가. 이전 agarose gel 제조시 사용한 comb을 깨끗히 세척하지 않아
comb 끝에 남아 있던 agarose가 새로 제조한 gel well에 남을 경우
나. gel 제조시 이물질 또는 균질화 되지 않은 상태로 gel 제조시
(gel을 액상화 시킬때 사용한 용기 세척 문제 포함)
다. 아주 희박하지만 tray 또는, comb 문제(새 제품으로 교체시 해결) -
답변
서준배님의 답변
2019-01-22- 2
비슷한 내용의 질문에 대한 답변을 찾은 내용입니다.
https://www.researchgate.net/post/PCR_product_retains_in_agarose_gel_well_during_electrophoresis-any_thoughts
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답변
최규석님의 답변
2019-01-22- 2
정크. pcr material 에서 나오는 high molecule 입니다
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답변
이평강님의 답변
2019-01-22- 2
wowphils님의 코멘트 외에 첨언드리자면,
loading dye를 바꿔보셨나요? well 부분에 junk가 생기는 거라면 loading dye를 제일 먼저 의심하고 싶습니다만, 새 걸로 써보세요. 그리고 PCR product 말고 control로 loading dye만 loading해서 내렸을 때도 생기는 거면 loading dye contamination이라고 봐야겠죠.
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답변
심우영님의 답변
2019-01-26- 1
Sample 자체에 염이 지나치게 많으면 그럴 수 있습니다.
PCR을 할 때, DW나 template에 염이 지나치게 많은지 확인을 해 보세요.
답변 감사드립니다.