2019-07-10
org.kosen.entty.User@8536f3f
서기원(majimotai)
- 5
안녕하세요... FACS 고수님들..
FACS로 sorting 후 culture 실험을 진행하고 있는데요,
부착 세포(BHK cell)이며, sorting 후 positive cell 수가 많지 않습니다. 10,000 개 수준 이하 입니다.
cell 수가 적을 경우, viability를 높이는 tip으로 곧바로 well plate에 배양하는 것보다는, conical tube에 그래로 둔체 incubator에서 overinight stainding 후 다음날 plate로 옮기는것이 더 유리하다는 의견을 받았습니다.
생각해보면, 세포가 더 밀집하여 있을수 있기 때문에 나쁘지 않은 방법이라는 생각이 드는데,
하지만, 부착세포의 경우는 바닥에 붙어야 growth나 recovery에 유리하다는 생각이 들어서요.
저의 경우 처럼, 부착세포의 경우도 conical tube에서 overinight stainding이 viability에 유리하게 작용할지 문의 드리고자 합니다.
경험이나, 의견, 참고 자료가 있으시면 어떤 것이든 의견 주셨으면 합니다.
감사합니다.
FACS로 sorting 후 culture 실험을 진행하고 있는데요,
부착 세포(BHK cell)이며, sorting 후 positive cell 수가 많지 않습니다. 10,000 개 수준 이하 입니다.
cell 수가 적을 경우, viability를 높이는 tip으로 곧바로 well plate에 배양하는 것보다는, conical tube에 그래로 둔체 incubator에서 overinight stainding 후 다음날 plate로 옮기는것이 더 유리하다는 의견을 받았습니다.
생각해보면, 세포가 더 밀집하여 있을수 있기 때문에 나쁘지 않은 방법이라는 생각이 드는데,
하지만, 부착세포의 경우는 바닥에 붙어야 growth나 recovery에 유리하다는 생각이 들어서요.
저의 경우 처럼, 부착세포의 경우도 conical tube에서 overinight stainding이 viability에 유리하게 작용할지 문의 드리고자 합니다.
경험이나, 의견, 참고 자료가 있으시면 어떤 것이든 의견 주셨으면 합니다.
감사합니다.
- FACS
- sorting
- cell culture
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 5
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답변
장성재님의 답변
2019-07-10- 3
제 개인적인 견해로는 "cell 수가 적을 경우, viability를 높이는 tip으로 곧바로 well plate에 배양하는 것보다는, conical tube에 그래로 둔체 incubator에서 overinight stainding 후 다음날 plate로 옮기는것이 더 유리하다"는 의견에 대해서 그리 큰 차이가 날 것 같지는 않습니다. 아시다시피 어차피 세포가 분열할 때에는 순간적으로 부착세포도 부착성이 없어지지요. 반대로 ㅂ착세포의 경우 세포가 밀집하여 있으면 growth inhibition이 발생할 수도 있습니다.
Sorting 후 10^4 정도의 세포를 얻으셨으면, 바로 flask에 배양하셔도 문제가 없을 것 같은데요.
재조합 단백질 생산을 위한 positive selection을 하셨다면, selective pressure를 가하며 single cell로 96 well plate에 배양을 하시며 가장 역가(생산량 또는 발현량)를 가진 세포를 선택하시길 추천합니다. 100파이 디쉬에 좀더 세포수를 희석하여 selective pressure를 가하며 배양을 하고 colony를 선택하여 다시 배양하실 수도 있겠지요.
Positive selection을 통해 발현이 높은 세포를 선택하셔서 배양하시는 데에는 많은 시간과 노력이 필요합니다.
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답변
이광호님의 답변
2019-07-10- 3
질문자님 말씀처럼 부착세포이니 바닥에 붙어야 원형의성질을 유지하고, 변형으로 실험조건이
달라지는 듯 차후에 문제가 생길수 있습니다. 또한 바닥에 붙어야 더 잘자라는 경우가 훨신 많기 때문에
제 생각에는 conical tube에 하는 것 보다
더 큰 well 여러장에 배양하시거나 아니면 그래도 많이 부족하다싶으시면
culture flask에 하시던지 그것도 더 여러장 하셔서 하시는게 더 좋지 않을까 생각합니다.
만약 세포양이 문제가 아니라 데드cell이 많아서 문제라면,
배양환경을 바꾸셔서야 (핸들링, medium 등등) 하지 않을까 싶습니다... 다양하게
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답변
심우영님의 답변
2019-07-11- 2
질문하신 분의 상황을 봤을 때 Conical tube에서의 O/N 배양은 추천하지 않습니다.
이런 경우 Adhesion cell의 경우 두 가지의 스트레스 요소가 들어갑니다.
attachment를 해서 자리를 잡아야 된다는 스트레스와 Conical tube 내에 세포 밀도가 오히려 생각보다 높기 때문에 그에 따른 스트레스..
이렇게 되면 세포의 캐릭터나 cell cycle이 변하게 됩니다.
차라리 well의 크기를 줄여서 세포의 밀도를 높여주되 빠르게 자리 잡을 수 있도록 일반 플레이트에 배양하는게 좋을 듯 합니다.
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답변
김형택님의 답변
2019-08-13- 1
1x10^4의 세포라고 하면 세포의 수가 적어보이지는 않습니다. 6well plate 정도의 size에서 세포의 밀집도를 높여 배양하면 충분히 원하시는 양을 얻을 것 같습니다.
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답변
김병국님의 답변
2019-08-20- 0
제 생각에도 그정도의 세포 수라면 적지는 않아 보여서 컬처 디쉬에서 배양하는 편이 더 좋을 것 같습니다. 위에 다른 분께서도 말씀해주셨는데 세포가 밀집되면서 생기는 스트레스가 제 경험상 영향이 더 클것 같습니다.
의견 감사드립니다.