2020-01-12
org.kosen.entty.User@ea75991
김주동(syncn310)
- 4
B cell culture에 괂련하여 질문이 있어 글을 남깁니다.
현재 Mouse splenic B cell을 CD19 positive selection으로 분리하여 실험을 진행하려 합니다.
Mouse (1마리)를 sacrifice해서 spleen을 꺼낸 후 MACS를 이용해 B cell을 분리하고 이렇게 얻은 B cell을 6 well plate에 seeding 하였습니다.
- 전체 spleen cell count는 1.2 x 10^8 이었고 여기서 분리한 B cell은 count하지 않았지만 대략 1.2 x 10^7이라 생각됩니다.
- cell은 6 well에 seeding하였으니 각 well당 약 2 x 10^6이 되겠습니다.
이렇게 cell seeding을 하고 여기에다가 LPS (or IgM) , CD40L를 넣어주고 10min 자극 후 cell을 모아서 washing 후 western sample을 만들었습니다. (p-p65를 보기 위해 10min 자극하였습니다.)
그리고 마지막으로 protein 농도를 확인하는데 거의 0.1ug/ml 정도의 매우 적은 양이 나왔습니다.
위의 계산대로라면 적어도 1ug/ml정도는 충분히 나올 수 있을 것 같은데 너무 적은 양이 나와서 실험 진행이 불가능한 상황입니다.
B cell culture에 경험이 있으신 분이 있으시면 조언 부탁드리겠습니다.
현재 Mouse splenic B cell을 CD19 positive selection으로 분리하여 실험을 진행하려 합니다.
Mouse (1마리)를 sacrifice해서 spleen을 꺼낸 후 MACS를 이용해 B cell을 분리하고 이렇게 얻은 B cell을 6 well plate에 seeding 하였습니다.
- 전체 spleen cell count는 1.2 x 10^8 이었고 여기서 분리한 B cell은 count하지 않았지만 대략 1.2 x 10^7이라 생각됩니다.
- cell은 6 well에 seeding하였으니 각 well당 약 2 x 10^6이 되겠습니다.
이렇게 cell seeding을 하고 여기에다가 LPS (or IgM) , CD40L를 넣어주고 10min 자극 후 cell을 모아서 washing 후 western sample을 만들었습니다. (p-p65를 보기 위해 10min 자극하였습니다.)
그리고 마지막으로 protein 농도를 확인하는데 거의 0.1ug/ml 정도의 매우 적은 양이 나왔습니다.
위의 계산대로라면 적어도 1ug/ml정도는 충분히 나올 수 있을 것 같은데 너무 적은 양이 나와서 실험 진행이 불가능한 상황입니다.
B cell culture에 경험이 있으신 분이 있으시면 조언 부탁드리겠습니다.
- B cell
- culture
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 4
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답변
김형택님의 답변
2020-01-20- 2
안녕하세요. 제가 B cell은 다뤄본 것은 아닙니다.
몇가지 말씀을 드리자면,
저 같은 경우 SH-SY5Y를 이용해서 실험을 해 봤을 때 LPS를 처리하면 매우 Toxic하여 초기에 논문을 기준으로 하여 적절한 농도를 먼저 찾았습니다.
저렇게 양이 적게 나온 것은 LPS로 인해 세포가 많이 죽어서 단백질이 적게 나온 것처럼 보입니다.
dose dependent 실험 후 다시 단백질을 얻어 보시는 것은 어떤지 조언을 드립니다. -
답변
손영옥님의 답변
2020-01-20- 2
10min 자극으로 세포들이 죽어서 단백질 농도가 적어진것 같지는 않습니다.계속 실험을 하셨다면 현미경으로 seeding된 세포를 확인해 보시면 세포 농도를 가름 하실수 있을듯 합니다. 혹은 2x106은 세포로 western 하기에는 충분하지 않은 세포로 생각되어 집니다. lysis 하실때 lysis buffer을 최대한 적게 하여 1번 lading 할 정도로만 하시면 이 상황에서 단백질 농도를 최대한 높일수 있는 방법으로 생각되어 집니다. -
답변
한민준님의 답변
2020-01-20- 2
RIPA lysis buffer를 사용하신것 인가요?
저 정도의 cell 양이면 50-100ul RIPA로 lysis 할 경우 충분한 단백질이 나와야 합니다.
그런데 단백질 정량하는 unit이 맞는것 인가요? ul로 따지면 0.1 ng이 나온것인데요..
너무 적은데요..
저는 보통 western의 경우 total 10ug loading 합니다..
RIPA로 lysis하고 BCA 로 단백질 정량을 해 보세요.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23225#/23225 -
답변
강경돈님의 답변
2020-01-30- 0
실험을 많이 해보셔서 아시는 내용이겠지만 혹시 도움이 될까해서 적어봅니다.
마우스가 여유가 있으시면 여러 마리 마우스에서 spleen을 적출하신 후 충분한 B cell을 isolation하시고 그 다음 western blot을 걸어서 band를 확인하시는 것이 순서 같습니다. 어느 정도 protein의 양을 걸어야 원하시는 밴드가 선명하게 보이는 지를 확인하셔야 여러가지 조건의 실험을 하실 때 어느 정도의 세포수가 필요한지를 정하실 수가 있으실 겁니다. 그리고 동시에 antibody가 제대로 역활을 하는지도 확인을 하시는거죠.
좋은 결과가 있으시길 응원하겠습니다.