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western blot 실험에서 antibody처리할 때 BSA를 용매로 하여 항체를 1:1000으로 처리하는데
여기서 궁금한 것은 여기서 BSA의 역할이 무엇인지 궁금합니다.
DW나 TBST를 용매로 사용하지 않고 BSA나 skim milk를 사용하는 것이 궁금합니다.
- western blot
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변
장성재님의 답변
2020-11-06- 4
사용하는 항체에 따라서 약간씩의 차이가 있지만, 주로 BSA는 membrane과 항체의 non-specific binding에 대한 blocking을 위해서 첨가합니다.Washing, blocking and antibody incubation
Blocking is a very important step of western blotting, as it prevents antibodies from binding to the membrane nonspecifically. Blocking is often made with 5% BSA or nonfat dried milk diluted in TBST to reduce the background.
Nonfat dried milk is often preferred as it is inexpensive and widely available. However, milk proteins are not compatible with all detection labels, so care must be taken to choose the appropriate blocking solution. For example, BSA blocking solutions are preferred with biotin and AP antibody labels, and antiphosphoprotein antibodies, since milk contains casein, which is itself a phosphoprotein and biotin, thus interfering with the assay results. It is often a good strategy to incubate the primary antibody with BSA since it is usually needed in higher amounts than the secondary antibody. Putting it in BSA solution allows the antibody to be reused, if the blot does not give good result.
아래 링크를 확인하시면 Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting 내용을 확인하실 수 있습니다.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3456489/ -
답변
김헌성님의 답변
2020-11-06- 3
간단하게 말씀드리면 Anti-bady를 좀더 안정적으로 반응 시키기 위해서이고요
또 하나는 중간에 blocking과정을 하기는 하지만 좀더 세밀하게 non-specific protein을 blocking하기 위해서 함께 섞어서 하기도 합니다. -
답변
변경필님의 답변
2020-11-06- 3
윗분들 답변에 추가 설명을 드리면,
젤에서 멤브레인에 옮겨간 확인하고자하는 단백질만 확인하기 위해 넣는 물질이라고 생각하시면됩니다.
항체가 타겟 단백질의 항원결정기(epitope)에 정확게 붙어야 하는데, 사용하는 항체 종류, 제조사등등에 따라 맴브레인의 다른곳에 가서 붙을 수 있습니다.
그래서 BSA 나 skim milk를 같이 넣어서 타킷 단백질이 없는 멤브레인의 빈공간에 항체와 경쟁시켜서 멤브레인에 먼저 붙게 붙게 만드는 것입니다.
젤에 있던 단백질을 멤브레인에 옮긴 후에, 빈 공간에 알려진 다른 단백질을 채워 항체가 엉뚱한곳에(멤브레인의 빈공간) 붙는 것을 방지 하는 원리 입니다.
이전에는 transfer 시킨후에 BSA 나 skim milk를 사용한 blocking을 먼저 시행후에 항체를 반응을 시켰습니다.
하지만, blocking 하는 시간이 아깝고, blocking하는 동안 타깃 단백질의 변성도 있을 수 있기 때문에, blocking과 antibody reation을 같이 시키기도 합니다. BSA 나 skim milk가 멤브레인에 결합하는 결합력이 항체보다는 좋아서 가능한 일이죠...
참고로, blocking를 별도로 하는 것이 결과가 이쁘게(?) 나옵니다.
마지막으로 BSA는 비쌉니다. 하지만, skim milk는 저렴합니다.
그렇다고 결과 품질 차이는 거의 없기 때문에 skim milk를 blocking시에 많이 사용합니다.
즐거운 불금되세요.
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김동화님의 답변
2020-11-06- 3
개인적으로 는 Antibody를 처리할때 1% BSA 와 0.3% Tween-20가 들어간 ？용액을 사용합니다.
또한 Blocking은 3% BSA와 5% skim milk를 혼용한 용액 (TBST)을 사용합니다. -
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한민준님의 답변
2020-11-05- 2
BSA는 carrier protein입니다. antibody도 protein이기 때문에 carrier protein을 넣어서 stability를 높여줍니다. western blotting의 경우 Tween (non-ionic detergent)과 carrier protein을 함께 넣어서 non-specific binding에 의한 백그라운드를 줄여줄수 있습니다.
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이광호님의 답변
2020-11-16- 1
BSA는 membrane과 antibody의 non-specific binding을 bloking 하는것이 큰 목적입니다.
그리고 외적으로 실험을 하면서 경험상으로 알게 되는것들인데
BSA로 하게 되면 실험결과가 좀 더 세게(?) 나옵니다. 항체반응이 진하게 나오고
좀더 세밀한부분까지 약한곳까지 더 발색이 나오는 편입니다. 결과가 잘 안나올때 어떻게든 발색이 되고 있다는 것을 보여주고 싶을때 저는 많이 이용하였구요.
그리고 skim milk는 실험결과를 깔끔(?)하게 만들때 더 이용합니다.
잡다한 발색을 줄여주고 specific한 메인 밴드만 딱 나오는 그림을 원할때 사용합니다.
그래서 목적에 따라서 이 두가지를 다르게 사용하고 % 용량을 조금씩 조절하며 실험컨티션을 맞추면 좋은 figure를 얻을 수 있습니다. -
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강경돈님의 답변
2020-11-19- 1
앞에서 모두 잘 설명해 주셨네요.
blocking할 때 skim milk와 BSA를 일반적으로 사용하게 됩니다.
하지만 각각의 회사별 antibody에 따라 blocking 조건이 다른 경우가 있습니다.
예를 들면 phosphorylation된 단백질을 위한 antibody라면 blocking solution으로 BSA를 사용하여야 합니다.
https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Western%20blotting%20of%20phospho-proteins%20protocol.pdf
대부분 antibody를 구입한 회사에 문의하면 구체적인 조건을 알려주니 조건을 잡기 전에 시간을 들여서 구입회사에 문의 후 실험을 시작하는 것이 전체적인 시간을 절약해 줄 때가 있습니다. -
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박애리님의 답변
2020-11-30- 1
BSA 넣으면 non-specific band를 blocking 해주는건 윗분들도 많이 알려주셨네요
갠적으로 blocking 할때만 3~5%BSA/TBST or skim milk/TBST 쓰는데요
1st antibody 이용할때는 그냥 TBST에 dilution 해서 하는 편이에요
antibody를 비교적 오랫동안 재사용도 가능한 편이라서요 ..
(BSA, skim milk 넣은 버퍼가 금방 상하기 쉽고 ㅠㅠ)