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웨스턴 블롯을 하는데 이제 갓 들어와서 프로토콜대로 하는데도 계속해서 밴드가 나비 모양으로 양옆에가 동그랗게 진하고 가운데 선은 연한 형태가 계속해서 나옵니다. ㅜㅠ
1well 당 20ul를 넣고 있고 러닝할때 12% gel로 100w에서 2시간 20분 정도로 시간을 잡고 있구요. 트랜스퍼의 경우 80w에서 2시간 정도 하고 있습니다. 그 후 스킴밀크 5%로 블락킹을 하고 있고 워싱은 10씩 3번하고 있습니다. 1차도 오버나잇하고, 2차는 1시간 정도하고 워싱 3번 후 찍는데 자꾸만 나비 모양(아령 모양)이 나와요
이유를 좀 알 수 있을까요 고수님들 제발 부탁드립니다!!
- 웨스턴 블랏
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변
한민준님의 답변
2023-12-22- 1
사진이 있으면 좀 더 이해하기 쉽겠지만
일단 유추해 볼 수 있는 문제점들은 아래와 같습니다.
단백질 양, 솔트 농도, 버퍼 pH 그리고 전압등이 있습니다.
20ul --> protein concentration은 얼마인가요? 10ug??
lysis buffer --> RIPA 쓰시나요?
running buffer --> 새로 만들었나요?
Tris-Hcl -->pH 정확한가요?
100w --> voltage가 얼마였나요? 전 보통 constant voltage로 사용합니다.
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답변
김헌성님의 답변
2024-01-05- 0
안녕하세요
제 생각에는 SDS PAGE를 내릴 때 문제가 있는거 같습니다
가장 먼저 의심해야할 것을 Voltage를 확인해 보시길 바랍니다.
stacking gel에서는 80voltage로 내리고
seperating gel로 넘어가면 100~120voltage로 sample buffer가 거의 빠질때 까지 내립니다.
그리고 gel 판 가운데를 SDS-PAGE buffer를 새것으로 넣었는지 확인해 보시길 바랍니다.
단백질 농도는 40ug입니다!
lysis buffer는 CETi lysis buffer를 사용하고
running 버퍼의 경우 재사용해서 쓰긴 했는데 새로 만들어 사용할 때도 똑같이 나왔습니다. ㅠㅠ
Tris-Hcl 버퍼의 경우 running gel 8.8 stacking gel 6.8로 사용하고 있습니다. Voltage의 경우 100V입니다!