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Inverse PCR로 vector가 제대로 만들어졌나 확인하고자 enzyme cut을 진행했는데요
enzyme cut으로 two cut을 하여 one band가 뜨면 PCR이 잘 됐고,
two band가 뜨면 실험이 제대로 진행되지 않은 것으로 디자인을 했습니다.
Two band가 나오긴했는데 예상한 size의 크기에 band(6 kb)가 하나 밝게 나오고
만약 two band가 나온다면 이쯤에 나올 것이라고 예측했던 size(500 bp정도)보다 훨씬 큰 위치(2 kb)에 희미한 잡밴드가 나았습니다.
잡밴드 까지 포함하면 만들어진 vector가 8 kb라는 얘기인데,
template도 그렇고 제가 만들려는 vector도 그렇고 size가 6~6.5 kb입니다.
enzyme으로 짤릴 부분을 다 확인도 했고, enzyme이 인식하는 사이트도 한 부분이라서 다른 곳을 자를 일은 없고
star activation을 생각하기엔 동일한 조건으로 enzyme cut을 하는 다른 동료들은 다 잘되기도 하고(template은 다릅니다)
glycerol 농도도 높지 않고 enzyme bfr도 다 호환되는 걸 사용했습니다. 시간도 4시간 동안 enzyme cut해서 뭔가
덜 잘렸을 것 같지는 않고...
뭔가 제가 생각한 부분 말고 다른 체크해야할 부분이 있을까요?
- enzyme cut
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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장성재님의 답변
2024-01-30- 0
다른 분이 동일한 실험을 진행해보면 어떨까요?
절차를 하나하나 살피면서 체크해주세요.
* 타겟의 시퀀싱은 진행하셨나요? 님께서 언급하신 부분을 제외하면 작업 환경 등의 contamination이거나 사용하신 RE의 contamination 정도가 남았을 것 같네요.