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western blot 후 membrane에 ECL을 뿌려서 detection하는 과정에서
처음엔 약한 강도(omitto)의 ECL로 먼저 확인을 합니다.
그런데 신호가 너무 약해서 detection이 안되면 강도가 쎈(femto) ECL을 뿌리고 detection합니다.
왠만하면 다 femto에서 background 없이 detection이 되는데
유독 한 cell의 하나의 target에서만 background가 심하게 나옵니다.
membrane을 필름 위에 올리고 pipette으로 ECL을 뿌린 다음 다른 필름으로 밀착되게 덮은 후에 detection하는데요
ECL을 뿌린 모양대로 background가 나옵니다.
그냥 membrane을 ECL에 담그듯이 넣었다 뺀 후 detection하면 전체적으로 background가 보이구요
Blocking도 더 오래하고 1차 항체 농도도 낮추고 했는데 여전합니다.
단백질 양을 줄이기엔 신호가 너무 약하게 나와서 아직 해보진 않았습니다.
해결할 수 있는 방법이 없을 까요
- western blot
- background
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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채택
한민준님의 답변
2024-05-28- 1
ECL에 femto를 10-20% 섞어서 사용하셔도 됩니다.
(ECL reagnet1 400uL+ reagent2 400uL+ femto reagent1 100uL+femto reagent2 100uL)
이런식으로 섞어서 사용했었습니다.
이러면 약한 시그널도 어느정도 백그라운 지저분한거 없이 잡힙니다.
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답변
조성혁님의 답변
2024-07-16- 0
Blocking 시간 2시간으로 올리시고 2차 항체 농도를 낮추고 washing buffer PBS or TBS 0.05 ~ 0.1 % Tween Mix하여 쓰실텐데 이외에도 PBS or TBS에 0.5 M sodium chloride + 0.2 % SDS 를 섞어서 Washing buffer로 쓰면 왠만한 Background는 줄어들 겁니다.
--> Quick washing 2번 진행하고 본 워싱 3번 진행하면됩니다.
ECL 에 물 섞어쓰면 membrane 재사용시 문제 생길 수 있습니다.
제가 사용하는 ECL femto 시약은 femtro reagent 1과 2를 섞어서 바로 사용하는 제품인데요
DW에 희석해서 사용해도 될 까요?