KOSEN 한인과학기술자네트워크

△ 단백질 생산공학

△ 미생물공장화

가. 단백질 생산공학 (Protein production engineering)

단백질 생산 공학은 단백질의 발현, 분리, 정제와 같은 단백질 생산에 관련된 전반적인 과정을 재조합 DNA 시스템을 이용하여 그 수율과 생산성을 증대시키는 분야입니다. 저희 연구실에서는 산업적으로 사용되는 효소나 의약용 단백질의 생산 수율과 생산성을 증대시키기는 연구를 수행 중입니다. 이러한 연구를 수행하기위한 방법으로 크게 본 연구실에서 독자적으로 개발한 단백질분비공학기술과 양이온성 융합체기술을 이용하고 있습니다.

1) 단백질분비공학 (protein secretion engineering)

저희 연구실에서는 유용 단백질을 생산하기 위한 숙주로서 대장균 (Escherichia coli)과 효모 (Saccharomyces cerevisiae)를 이용하고 있습니다. S. cerevisiae를 숙주로 이용하여 생성되는 단백질은 일반적으로 안전하다고 인정되는 물질 (GRAS, Generally Recognized As Safe)로 여겨지며, 여러 가지 장점을 가지고 있습니다. 먼저 S. cerevisiae는 모든 유전 서열이 밝혀져있으며, 생리학적인 정보 또한 다양한 연구를 통해 밝혀져 있어 대사 경로의 설계가 용의 하다는 장점을 지닙니다. S. cerevisiae 가 갖는 또 다른 장점은 단세포 진핵 세포라는 점입니다. 진핵 생물이 갖는 DNA 복제, 전사, 단백질 번역 후 변형 (Posttranslational modification machinery), 대사 과정 등의 특징을 보유하고 있으면서도 유전학적 도구들이 다양하고 조작이 쉽다는 특징을 갖습니다. 따라서 S. cerevisiae는 진핵 세포에서 생성되는 단백질을 생산할 수 있는 장점을 갖습니다. 저희 연구실에서는 S. cerevisiae을 이용하여 대사 경로를 재설계하고 유전자 발현 양상을 조절하는 방법을 통해 유용 단백질의 생산을 증대시키는 연구를 진행하고 있습니다. 이러한 연구의 결과로 혈액 항 응고 단백질인 hirudin이나 항암 치료제로 사용될 수 있는 항 혈관형성 단백질인 LK8, 감염성 간질환을 유발하는 hepatitis B 바이러스의 치료연구에 이용될 수 있는 표면 항원의 도메인, 바이오디젤의 생산과 세제 성분으로 이용되는 캔디다 유래 리파아제 등 유용 단백질의 생산과 관련된 다양한 기술을 개발하였습니다. 구체적으로, 생산하는 단백질의 접힘과 분비를 용이하게 하기 위해 이황화결합이나 단백질 이동을 돕는 기능을 하는 보조 단백질들과 post-Golgi 경로에 관련된 보조 단백질들을 공발현 하는 시스템을 구축하였습니다. 한 예로 단백질의 접힘과 이황화결합의 도움을 주는 PDI1을 공발현 한 경우 목적 단백질의 생산량이 2배에서 10배가량 향상되는 효과를 관찰할 수 있었습니다. 또한 이러한 목적 단백질의 안정적인 과발현을 위해 δ-sequence를 이용해 효모의 염색체에 목적 단백질을 암호화하는 유전자를multi-copy로 integration시키는 시스템을 구축하여 단백질 생산 수율과 생산성을 크게 향상시켰습니다.

△ 효모에서의 단백질 생산 및 분비 경로

△ δ-sequence를 이용한 단백질의
안정적 생산용 벡터개발

2) 양이온성 융합체를 이용한 단백질 생산 (Polycation tag for purification & refolding)

유전자 클로닝 기술은 굉장히 빠른 속도로 개발되고 있는데 그 중에서 단백질 융합기술은 목적유전자의 생산을 원활하게 하기 위한 목적을 가지고 ‘carrier' 또는 ’partner'라도 불리는 또 다른 단백질을 유전자 형태로 결합시키는 것으로 정의됩니다. 이러한 유전자 또는 단백질 융합기술은 목적 단백질 발현효율의 증대, 비활성 봉입체 (inclusion body) 형성을 저해, 활성형 목적 단백질의 간단한 정제기술 개발 등의 목적으로 개발되었습니다. 대부분의 E. coli 세포내 단백질의 등전점 (pI)의 분포를 살펴보면 일반적으로 약한 산성의 pI를 가지고 있습니다. 대략 95%의 세포내 단백질은 등전점이 pH7.4 이하이고 5%가 염기성 pH를 갖는데, 이는 염기성 pH에서 95% 이상의 단백질이 음이온성으로 존재하게 되기 때문에 양이온성으로 존재하는 단백질만이 양이온 교환수지에 부착하게 되어 쉽게 분리할 수 있다는 것을 착안하였습니다. 이렇게 개발된 양이온교환수지는 현재 산업적으로 단백질 정제에 가장 많이 사용되고 있는 다른 실험용 tag (His-6 tag, protein A, GST tag)보다 3배가량 저렴하여 산업적으로 적용하기에 보다 유리합니다. 본 연구실에서는 이러한 기술을 이용하여 식품용 효소인 cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase)와 의약품용 단백질인 glucagon like peptide-1 (GLP-1), 캔디다 유래 리파아제를 재조합 대장균을 이용하여 고농도/고순도로 생산하는 방법을 개발하였습니다. 양이온성 융합체 (fusion tag)는 융합 단백질의 정제뿐만 아니라 양이온교환수지와의 강한 결합 특성을 이용하여 재조합 대장균에서 비활성 봉입체 (inclusion body)로 생산되는 목적 융합단백질의 재접힘 (refolding)과정에도 효과적으로 이용됩니다. 간략하게 설명하면 비활성 융합단백질 봉입체 (inclusion body)를 다양한 단백질 풀림제 (guanidine hydrochloride 또는 urea 등)로 풀어헤친 후에 양이온교환수지에 용해된 단백질 용액을 주입하여 융합단백질을 고정상에 부착한 이후 재접힘 (refolding) 완충용액을 주입하여 풀린 융합단백질을 활성형 재접힘 단백질로 전환시키는 기술입니다. 이러한 결과를 바탕으로 볼 때 본 연구실에서 개발한 양이온성 융합체는 목적단백질 중 수용성 단백질의 고순도/고농도 정제와 비수용성 단백질의 효율적인 재접힘, 목적단백질 효소의 고정화반응기 개발 등 광범위한 단백질 및 효소 공학 분야의 토털솔루션(total solution)을 제공하고 있습니다.

△ 재조합 대장균의 단백질체 분석 및
양이온성 융합체 (fusion partner)를 이용한 정제 방법

△ 양이온성 융합체 (fusion partner)의 다양한 기능

나. 미생물공장화기술 (Microbial Factory Technology)

미생물 이용 기술은 안전성과 친환경적인 특징을 가지고 있어, 화학물질을 생산하는 분야에도 널리 이용되고 있습니다. 생명공학의 발달로 미생물의 대사경로를 조작하는 방법이 개발되어 미생물을 개량할 수 있게 되었습니다. 다양한 genomics, proteomics, metabolomic와 같은 대사공학기술의 발달은 미생물을 단순한 세포가 아닌 미생물세포공장으로 이용할 수 있게 하였습니다. 이러한 최신의 유전공학기법을 이용하여 최적 환경에서 목질계 당화액과 식품산업 부산물 원료로부터 고부가가치의 물질을 친환경적으로 생산하는 기술을 미생물공장화기술이라고 합니다.

1) 생물공학적 방법을 이용한 자일리톨 생산

자일리톨은 설탕을 대체 할 수 있는 고부가가치 천연 감미료로, 생체 내 효소에 의해 대사되지 않아 식품 감미료, 의약품 첨가제 등으로 사용되고 있습니다. 자일리톨은 천연물로부터 추출하거나 화학적인 방법, 미생물을 이용하여 생산하는 방법을 통해 생산할 수 있는데, 본 연구실에서는 생물공학적인 방법을 이용하여 Saccharomyces cerevisiae에서 자일리톨을 생산하는 연구를 수행 중에 있습니다. 화학적인 방법과는 달리 생물공학적인 방법을 이용하면 온화한 반응 조건에서, 높은 수율로 자일리톨을 생산할 수 있으며, 환경 오염 물질의 배출을 줄일 수 있다는 장점을 갖습니다. 자일리톨 생산 연구에 이용한 S. cerevisiae균주는 본래 자일로스를 탄소원으로 이용할 수 없어, 자일로스를 대사 할 수 있는 Scheffersomyces stipitis로부터 자일로스 환원효소를 (XR) 암호화하는 유전자를 S. cerevisiae내에 도입하였습니다. 이를 통하여 자일로스 환원효소를 발현하는 형질전환된 S. cerevisiae에서 xylose로부터 xylitol을 고수율로 생산할 수 있게 되었습니다. 이러한 생물공학적 자일리톨 생산 방법은 순도가 낮은 자일로스를 원료로 이용할 수 있고, 반응이 종료된 후 잔류하는 자일로스가 없는 장점을 가지고 있습니다. 그러나 S. stipitis 유래의 자일로스 환원효소만을 발현하여 자일리톨을 생산할 경우, S. stipitis 유래 자일로스 환원효소가 보조인자로서 NADPH만을 이용하기 때문에 세포 내의 보조인자 불균형으로 인하여 자일리톨 생산이 제약을 받게 됩니다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 본 연구실에서는 NADPH 의존성 자일로스 환원효소를 암호화하는 유전자와 NADH 의존성 변이체 자일로스 환원효소를 암호화하는 유전자를 모두 도입하여 자일리톨 생산에 NADPH와 NADH를 모두 이용하는 재조합 S cerevisiae를 제조하였습니다. 또한 추가적으로 세포 내 NADPH와 NADH pool을 증가시키기 위해서 ZWF1, ACS1 유전자를 각각 과발현하여 자일리톨 생산성을 증가시켰습니다. 마지막 단계로 기질공급방법, aeration등의 생산 공정을 최적화하여 S.cerevisiae에서 자일리톨의 생산성을 높이는 연구를 진행 중에 있습니다.

△ 자일리톨 제조방법

△ 재조합 효모에서의 자일리톨 생산경로

2) 섬유소 자원을 이용한 에탄올 생산 (Celluosic bioethanol production)

현재 인류는 과다한 석유의 사용으로 대기 중 이산화탄소 농도가 급격히 증가하였으며 이로 인한 지구온난화, 기상이변과 같은 환경문제를 야기하고 있습니다. 온실가스 배출에 대한 국제적인 환경 규제에 대응하면서 석유를 대체할 수 있는 친환경 수송용 연료로서 바이오에탄올이 각광을 받고 있습니다. 식량자원을 이용하여 생산하는 바이오에탄올을 제 1세대 바이오에탄올이라 하고, 섬유소와 같은 비식량자원에서부터 생산되는 바이오에탄올을 제 2세대 바이오에탄올이라 합니다. 현재에는 바이오에탄올의 생산을 위한 원료로 옥수수와 같은 식량자원이 아닌 비식량자원이어야 한다는 것이 국제적인 공감대입니다. 그러나 이러한 섬유소계 비식량자원은 C5 당류인 자일로스와 아라비노스를 포함하고 있어 기술적인 어려움이 존재합니다. 전통적으로 에탄올 발효에 많이 이용되는 S. cerevisiae의 경우 높은 에탄올 수율과 생산성 및 고농도 에탄올에 대한 내성을 가지고 있지만 이러한 C5 당류를 발효할 수 있는 대사경로를 가지지 않는다는 단점을 지니고 있기 때문입니다. 본 연구실은 섬유소 자원 중 헤미셀룰로스에 다량으로 포함되어 있는 자일로스로부터 바이오에탄올을 생성하기 위해 S. cerevisiae에 자일로스 대사 관련 효소인 자일로스 환원효소 (xylose reductase), 자일리톨 탈수소화효소 (xylitol dehydrogenase), 자일룰로스 인산화효소 (xylulokinase)를 암호화하는 유전자를 아래 그림과 같이 도입하여 자일로스가 바이오 에탄올 대사 경로에 도입될 수 있도록 대사 과정을 설계하였습니다. 이 때, 자일로스 환원효소와 자일리톨 탈수소화효소 간의 서로 다른 보조인자 의존성 때문에 유발되는 산화 · 환원 불균형은 에탄올을 생성하는데 주요한 원인이 됩니다. 이를 해결하기 위해 본 연구실에서는 단백질 공학기술을 이용하여 자일로스 환원효소의 보조인자 선호도를 바꾸어 산화 · 환원 균형을 맞추어주는 연구를 수행하였습니다. 이와 더불어 현재에는 이러한 자일로스 환원효소들의 합성 아이소자임 (Synthetic isozyme) 시스템을 구축 및 규명하는 연구와 자일로스 대사 증진 유전자들의 스크리닝 연구를 수행 중에 있습니다. 이 연구들은 미국 일리노이대학과 국민대학교 교수님들과 협력하여 진행하고 있습니다.

△ 섬유소계 바이오매스의 구성성분

△ S. cerevisiae에 도입된 자일로스 대사경로

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