1. 연구실 소개
저희 줄기세포발생학연구실은 만능줄기세포 형성 기술을 이용한 인간 유도만능줄기세포(iPS cells)을 이용한 질병연구, 줄기세포의 분화능 연구를 통한 신경세포세포 또는 미니 뇌조직(뇌오가노이드) 형성 및 응용 연구, 배아 발생과정에서 일어나는 미토콘드리아 변화, 후생유전을 포함한 여러 가지 현상을 연구하고 있습니다. 특히, 체세포 리프로그래밍에 의한 만능성 획득에 관한 연구를 기반으로 형성된 다양한 유도만능줄기세포 생산 기술을 확보하고 있으며, 신경세포로의 분화를 통한 뇌질환 연구를 주로 수행 하고 있습니다.
[만능성 (Pluripotency)]: 내배엽, 중배엽, 외배엽 및 생식세포로 분화할 수 있는 능력. 대표적인 만능성 세포는 배아줄기세포이다.
[리프로그래밍; 역분화(Reprogramming)]: 세포가 가지고 있는 기존의 후생유전적 기억을 지우고 새로운 정보를 수립해가는 과정으로 세포가 가지고 있는 프로그램, 즉 수정 이후 배발달을 거쳐 각 조직으로 분화하고 각 조직에서 기 기능을 수행하다 죽게 되어 있는 체세포의 프로그램의 방향을 역으로 되돌려 초기 배아단계의 능력을 다시 획득하는 것을 의미한다.
[역분화 만능줄기세포, 유도 만능줄기세포(induced pluripotent stem cells (iPS cells))]: 분화된 체세포에서 역분화되어 만능성(pluripotency)을 획득한 줄기세포로 배아줄기세포와 유사한 특성을 지님 . 2006년 일본 교토대학 야마나까 교수에 의해 처음 개발된 이후 핵치환 기술을 대체할 수 있는 기술로 세계적으로 각광을 받고 있음.
[후성유전학(epigenomics)]: 유전자의 염기배열에 변화 없이 유전자의 발현을 조절하며, 세포가 분열하는 과정에서 딸세포로 그대로 전달이되는 것을 후성 유전이라함.
2. 주요 연구 분야
뇌오가노이드(Brain Organoid)
-1907년 개구리 초기 배아에서 뉴론을 배양한 것을 시작으로, 이후 성체 뇌로부터 신경줄기세포를 배양할 수 있음을 밝혀지고, neurosphere형태로 신경줄기세포를 유지하는 기술이 개발되었다. 하지만, 최근에는 생체모사 조직을 위해서는 뇌조직을 모사하는, 조직형태의 배양 시스템이 유용하므로 뇌 오가노이드 배양 개발이 본격화 되기 시작했다.줄기세포발생학 연구실에서는 인간 유도만능줄기세포를 이용하여 인간 뇌오가노이드 만들고, 이를 이용한 뇌질환 연구를 수행하고 있다.
-전뇌, 중뇌, 후퇴 및 시각 조직을 포함하는 whole-brain organoid 배양이 가능하며, 연구 목적에 따라 전체 또는 일부 뇌조직 배양이 가능하다.
-염광염색으로 확인한 결과 안쪽은 신경줄기세포(Sox2+), 바깥쪽은 분화된 신경세포층을 형성하고 있는 오가노이드가 형성됨을 확인함.
세포 리프로그래밍을 통한 안전한 유도만능줄기세포 기술 개발(환자 유도만능줄기세포 이용한 질환 연구)
-역분화의 역사는 최초의 체세포 핵치환 기술의 성공에 의해서 가능함이 보고되었다. 즉, 핵이 제거된 난자에 분화된 체세포를 이식하여, 이식된 체세포가 난자내에 존재하는 역분화 인자에 의해 초기 발달단계상태로 되돌아가게 되며, 체세포의 핵은 일반 배아의 발달과정을 거치면서 정상적인 개체로 태어날 수 있음이 1997년 체세포 복제양 '돌리‘의 탄생에 의해 입증되었다.
-또 다른 방법은, 체세포가 배아줄기세포와 융합되어 하나의 세포가 되면, 체세포의 핵은 역분화를 거쳐 만능성을 획득하여 배아줄기세포의 특징을 획득 하게된다. 세포융합에 의한 역분화는 24-48시간내에 일어나는 매우 빠르고 효율적인 역분화 방법으로 역분화에 필요한 인자 및 기전 연구에 사용되고 왔다.
-최근에는 배아줄기세포의 도움이 없이 네 가지의 전사인자(핵내 존재하는 인자), Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 만으로 분화된 체세포를 배아줄기세포와 동일한 형태와 능력을 지닌 역분화 만능줄기세포(induced pluripotent stem cells)의 개발에 이르렀다(Takahashi and Yamanaka, 2006). 이 역분화 만능줄기세포는 배아줄기세포와 같이 만능성을 지니고 있어, 내배엽, 중배엽, 외배엽 세포 및 정자 및 난자와 같은 생식세포로 분화 할 수 있는 능력을 가지고 있다.
-초기 유도만능줄기세포 생산 방법은 바이러스를 이용한 역분화 인자의 과발현을 유도하는 것이다. 하지만, 바이러스를 이용할 경우 바이러스 유래 유전자가 세포에 삽입되어 유전자의 변화가 생긴다.
-따라서, 본 연구실에서는 단백질 또는 플라스미드를 이용한 유전자 내 외래유전자 삽입 없는 다양한 세포 리프로그래밍 방법을 개발하였다.
▷ 나노튜브(nanotube)와 단백질(Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog)을 이용한 리프로그래밍
▷ 플라스미드를 이용한 리프로그래밍 유전자 transfection을 통한 리프로그래밍
▷ 센다이바이러스를 이용한 외래유전자 삽입없는 유도만능줄기세포 생산 리프로그래밍 기법
-플라스미드 및 센타이바이러스를 이용하여 인간 체세포를 이용한 인간 유도만능줄기세포를 생산하였으며, 프래더윌리증후군, 레트증후군 등의 뇌질환 환자의 세포를 이용한 환자 유도만능줄기세포를 수립하여, 뇌질환 연구를 하고 있음.
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신경 줄기세포로의 분화(in vitro 분화, in vivo 분화)
(1) 체외 분화
-배아줄기세포(ES cells), 유도만능줄기세포(iPS 세포s), 에피블라스트줄기세포(EpiSCs)에서의 신경줄기세포로의 체외 분화의 다양한 기술을 개발하고 있다..
- EpiSCs과 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 모두 신경줄기세포로 분화가 가능하며, 수립 이후에는 비슷한 형태와 신경줄기세포 마커를 발현한다.
(2) 체내 분화
- 체내 시스템(테라토마 형성유도)을 이용하여 신경줄기세포를 분화하는 기술을 개발하고 특허를 취득하였다(2016년). 이렇게 생성된 체내 신경줄기세포는 체외에서 분화된 세포보다 뇌조직의 신경줄기세포와 보다 가까운 특징을 보이고 있어 매우 유용한 신경줄기세포 분화 방법이다.
- 만능줄기세포를 생쥐의 피하(subcutaneous) 또는 testis capsule에 주입하면 테라토마(teratoma) 형성하는데, 이 테라토마는 만능세포로부터 증식 및 분화된 세포로 형성된 종양의 일종으로 내배엽, 중배엽, 외배엽 조직을 모두 포함하고 있다. 이 테라토마에 존재하고 있는 만능줄기세포 유래의 여러 조직세포 중에서 신경줄기세포를 추출하여 체내 신경줄기세포를 생산하는 방법을 개발하였다. 이렇게 수립된 만능줄기세포로부터 만들어진 테라토마 유래 신경줄기세포는 신경줄기세포 마커(Nestin, Musashi)를 발현하며, 정상적으로 neuron, astrocyte, oligodendrocyte로의 분화가 가능하다. 이 연구는 체내에서 형성된 신경줄기세포를 배양하는 새로운 만능줄기세포 분화 기술이다.
미토콘드리아와 질환과의 연관성 연구
- 미토콘드리아는 자체의 유전물질을 가지고 있으며, 세포의 생존에 관계되는 대사에 중요한 역할을 하는 세포내 소기관이며, 미토콘드리아 기능의 감소는 세포의 노화, 암, 신경계 질환, 근육 기능 약화, 간 기능 약화 등 다양한 조직 세포에 영향을 미치고 있는 것으로 알려져 있다.
- 미토콘드리아는 fusion과 fission을 반복하면서 세포 내에서 미토콘드리아의 형태 변화를 일으킴으로써, 세포 타입에 따라 미토콘드리아의 변형을 통한 각 세포의 대사 변화에 영향을 주며, 미토콘드리아는 세포의 분화 과정과 매우 밀접한 관계가 있음을 나타내고 있다.
- 또한 퇴행성 신경질환인 알츠하이머, 파킨슨, 헌팅턴 질환의 경우 모두 미토콘드리아의 이상이 관찰되고 있으며, 미토콘드리아 형태 변화에 관련된 유전자 Drp1, Mfn2, Opa1등의 유전자 발현이 세포의 노화, 암, 신경질환 관련 단백질과의 연관관계가 있는 것으로 보고되고 있다.
- 본 실험실에서는 분화과정에서의 미토콘드리아의 변화와 퇴행성 신경질환에서의 미토콘드리아의 관계를 통합적으로 연구를 수행하고 있으며, 신경질환 환자 세포를 이용한 연구를 통해 신경질환 환자에서의 미토콘드리아의 변화 관련 유전자의 질환과의 연관서에 대한 연구를 하고 있다.
만능줄기세포(완전만능성, 준만능성 줄기세포 기전연구)
- 만능줄기세포는 크게 두 분류로 나뉜다. 완전만능줄기세포(naive pluripotent stem cells)와 준만능줄기세포(primed pluripotent stem cells)로 나뉘는데 모두 체외에서 분화하여 몸을 구성하는 모든 조직세포로 분화가 가능하지만, 준만능줄기세포는 분화과정의 특징을 보이고 있으며, 배반포에 주입 후 체내 발달능이 없어 키메라를 형성하지 못하는 큰 차이를 보인다. 이러한 이유로, 두 만능줄기세포는 배양액 조성 및 분화 조건 또한 다르다.
- 본 실험실에서는 완전만능줄기세포와 준만능줄기세포의 분화능 차이 및 유지/분화과정에서의 근본 메카니즘을 찾기 위한 연구를 수행중이다.
- 최근, Oct4를 이용해 두 만능줄기세포를 형광 색깔로 구별하는 방법을 개발했다. Oct4의 발현에 있어 완전만능줄기세포는 원위 인헨서(distal enhancer)에 의해 활성화되며, 준만능줄기세포는 근위 인헨서(proximal enhancer)에 의해 활성화된다. 이 두 가지 만능줄기세포를 인헨서 활성화에 따라 각각 초록형광단백질(GFP)과 빨강형광단백질(RFP)이 발현되는 이중 형광 형질전환 생쥐를 제작했다. 이 생쥐의 세포를 이용하여 완전만능줄기세포와 준만능줄기세포의 특징을 분석하는 연구가 진행중이다.
줄기세포 후생유전학 (DNA methylation, 유전체 각인, X 염색체 불활성화)
후생유전이란, 유전자의 DNA의 변화 없이 유전자의 발현을 조절하며, 세포가 분열하면서도 딸세포에도 전이가 되는 현상을 말한다. DNA 메틸화, 히스톤 메틸화 및 아세틸화, X chromosome의 활성화, 각인 유전자의 변화 등이 이에 속한다. 후생유전을 이해하는 것이 유전자 발현을 이해하는 가장 근본적인 기전 연구의 방향이 된다. 따라서, 줄기세포 및 세포역분화 과정을 이해함으로써 생명 현상에 관한 기초 정보를 제공할 수 있을 뿐 만 아니라, 이러한 기초 정보를 통해 줄기세포가 사람을 치료하기위한 재료로써 안전하다는 것을 증명할 수 있을 것이다.
(1) DNA methylation (DNA 메틸화)
- DNA 메틸화는 Cytosine의 5번째 탄소에 메틸기가 붙어 형성되어 cytosine이 methylcytosine으로 변화하는 것을 말한다. DNA 상에 메틸cytosine이 형성되면, 그 주위의 유전자는 응축되어 유전자 발현이 억제된다.
- DNA 메틸화는 주로 CpG dinucleotide에서 일어나는데 이를 CpG methylation이라고 하며, 그 이외 CpA, CpC, CpT 에서도 일어나는데 이를 non-CpG methylation 이라고 한다.
- 만능줄기세포의 분화과정에서의 CpG methylation과 non-CpG methylation의 변화를 관찰하고, 정상적인 DNA methylation pattern의 수립이 이루어지는가를 연구하고 있다.
(2) 유전체 각인
- 유전체 각인 및 각인 유전자: 부계와 모계로부터 물려받는 유전정보는 멘델의 법칙에 의해 그 발현이 결정되지만, 이 법칙에 따르지 않는 수십 종의 유전자군이 존재한다. 이들 유전자군은 부계 또는 모계의 어느 한쪽의 유전자만이 발현되는데, 이런 현상을 유전체 각인(genomic imprinting)이라고 하며, 유전체 각인 현상을 보이는 유전자를 각인유전자(imprinted gene)라 한다.
- 유전체 각인은 세포의 상태에 따라 변화하기도 하는데, 만능줄기세포 상태에서는 유전체 각인이 변화하는 것으로 알려져 있다. 이러한 특징을 이용하여 유전체 각인 이상 유전질환을 치료하는 연구가 진행중이다.
(3) X 염색체 불활성화
- 여성 체세포는 두 개의 X 염색체를 포함하고 있는데, 두 개의 X 염색체 중 하나는 불활성화되어 있다. 이러한 현상을 ‘X 염색체 불활성화(X chromosome inactivation)'라고 하며 불활성화된 X 염색체를 ‘불활성 X 염색체(inactive X chromosome)'라고 한다.
- 이 불활성 X염색체에 존재하는 대부분의 유전자들은 발현하지 않는 상태로 평생 지속된다. 하지만, 이 불활성 X염색체가 역분화되어 만능성을 획득하면, 활성화가 일어난다, 즉 ‘X 염색체 재활성화'가 일어나는 것이다. 이 현상은 X 염색체 두 개를 포함하고 있는 자성 체세포(female somatic cells)를 이용한 역분화 과정에서만 일어나는 현상이다.
- 최근 X 염색체 재활성화가 유도만능줄기세포에서 일어나며, 이 과정은 매우 천천히 일어나는 것을 확인한바 있다.
