변이종 코로나바이러스의 출현과 재출현의 조기 탐지를 위
2020-07-04
org.kosen.entty.User@dd9d528
신영오(yoongoh50)
변이종 코로나바이러스의 출현과 재출현의 조기 탐지를 위한 모니터링 체제 수립
신영오, yungoh@kangwon.ac.kr
한국산업기술진흥협회
Key words
CoVID-19, SARS-CoV-2, CoV-19 RNA in wastewater, early detection of CoV-19 emergence, prevention of CoV-19 pandemic, 코로나19, 코로나바이러스-19, 감염병 조기예보, 코로나19 유행의 조기탐지, 하수기반 역학
1. 개요
코로나19는 2019년에 중국에서 발생하여 2020년 6월 말 현재 219개 국가에서 거의 1 천만명의 환자와 50여만명의 사망자를 발생시키고 그 유행을 계속하고 있다. 우리나라는 1만3천여명의 확진자와 282명의 사망을 보이고 있으면서 낮은 수준의 유행이 계속되고 있다. 현재 코로나19의 방역에서 가장 큰 이슈 중의 하나는 이 유행이 끝난 후에 코로나바이러스―19의 출현을 빠른 시기에 찾아내는 일이다. 즉 최근에 보고된 역학 기술을 최대로 활용하는 것이 또 다른 피해를 최소화하는 길이다. 근래에 특정 지역에서의 감염자 유행을 조기에 발견하는 방법으로서 하수에 대한 코로나바이러스-19 RNA의 존재를 검사하는 방법들이 분자생물학적 방법과 통계학적 방법의 결합으로 개발되어 실제 이용되고 있다. 이 방법은 아직 여러 가지 보완의 필요성이 있으나 개선시키는 경우, 지역 내 유행의 조기 발견은 물론이고 감염 추세를 보다 정확하게 규명할 수 있는 것으로 조사되고 있다. 현재 전 세계적으로 10여개 국가가 하수기반역학(wasterwater based epidemiology)도구인 하수 내의 코로나바이러스-19 RNA의 존재를 보고하고 있어 이들 내용을 소개한다. 이와 관련하여 우리나라는 2000년부터 전국적으로 대형 정수장의 원수 및 처리 수에 대한 바이러스 검사를 제도적으로 시행해 오고 있다. 즉 수돗물 관련 원수에 대한 “총 배양성 바이러스”를 검사해 오고 있어 장내바이러스를 위주로 한 바이러스 종류와 그 수를 측정하는 검사 시스템을 갖고 있다. 따라서 이 제도에 코로나바이러스-19 RNA검사를 결합하여 코로나19 재유행의 조속한 탐지와 보다 정확한 유행 수준을 파악할 수 있을 것으로 판단된다. 국내에서도 코로나19 조기 발견을 위하여 지역인으로부터 배출되는 하수에 대한 조직적인 검사 제도의 도입, 시행을 제시한다.
2. 하수에서의 코로나바이러스-19 RNA 검사
2.1. 하수에서 코로나19 RNA 검사 방법의 필요성
코로나19는 발생이 시작된 이후 반년이 지난 지금에도 감염자, 환자 및 경제적 피해 등이 늘어나고 있다[1]. 그럼에도 불구하고 이번 팬데믹은 여러 국가들이 지역을 폐쇄(lock-down)하는 등의 강력한 조치들을 취하는 등 각종 역학적 조치들과 함께 감염병의 특성으로 인하여 종국적으로 기간의 차이는 있으나 감소 과정을 거쳐 유행이 종식될 것으로 예상된다. 그러나 유행이 끝난 이후 다시 코로나감염증-19 팬데믹의 출현, 혹은 재출현의 가능성은 상존하고 있다. 특정 국가나 지역에서 코로나-19의 유행을 최단기간 내에 탐지하는 방법으로 현재 사용하는 개별 의심자에 대한 열 측정, 임상 및 실험실 검사 방법은 매우 어려움이 수반된다. 개별검사 방법은 미증상 감염자와 잠복기 감염자가 바이러스를 배출하고 있음에도 불구하고 실제적으로 바이러스의 존재를 확인하기 어렵다. 또한 개별 임상 검사는 확진 과정과 보고 체계 등을 고려하면 하수 내 RNA 검사보다 7, 8일이 늦을 수 있어 조기 대응이 비효율적이다[2]. 즉 방역에서 치명적 시기를 넘기는 문제점을 갖고 있다. 근래 네덜란드 등 수개 국가의 연구자들이 이러한 코로나19의 출현, 재출현의 조기탐지를 위한 방법으로 하수 처리 공장에서 CoV19의 RNA를 탐지를 보고하였다[3]. 따라서 하수 내 바이러스 RNA 검사 방법을 도입하여 보다 빠른 시기에 새로운 유행을 찾는 방법의 이해와 도입이 필요하다.
2.2. 지역 하수 체계에서 코로나바이러스-19 RNA의 존재 확인
특정 지역에서 코로나바이러스-19 감염자가 발생하는 경우, 그 지역의 하수에서는 코로나19 RNA가 지속적으로 발견된다. 감염자의 분변으로부터 바이러스 배출 기간은 바이러스 감염 후 14-21일 동안이며 감염자에 따라서 차이가 많다. 배출되는 바이러스의 양은 분변 1 그람 당 102 내지 108까지의 RNA 사본(copy) 수를 보인다. 하수 등 환경에서 바이러스의 활성 유지는 온도, pH 값, 광선 및 소독제 등에 따라서 결정된다. 하수에서 외막이 있는 바이러스인 CoV를 처음으로 탐지한 것은 2013년 Wong들에 의하여 이루어졌다(4). 이들은 마이크로배열(microarray) 방법을 사용하여서 하수 시료 12 건 중, 1건의 시료에서 RNA를 탐지하였다. 2004년 사스 환자 입원 병원에서 확보된 소독 처리된 하수의 30%에서 사스바이러스 RNA가 탐지되었다. 프랑스에서는 처리 하수에서 리터당 106승 RNA 커피수를 보고하였다.
2.3. 우리나라 원수에서의 감염성 바이러스 시험
하수에서 바이러스 RNA를 참지하는 체계와는 별개로 우리나라에서는 수돗물 원수 등에 대한 감염성 바이러스 검사가 20여년 동안 이어지고 있다. 1999년 국내에서 인구의 다수가 사용하는 수돗물에서 감염성 상태의 바이러스가 유행성수막염 유행병의 원인이 된다는 주장이 제기되었다. 이에 대응하여 서울특별시, 국립환경연구원(원장: 류재근) 및 환경부(장관: 김명자) 등 관계 기관에서는 대한바이러스학회에 “수돗물 관련 바이러스표준분석방법 및 분석 인증제도 연구”를 의뢰하였다. 해당 학회에서는 미국 EPA의 “Total Culturable Virus Quantal Assay”(5) 및 일본 등 외국의 기준을 참고로 하여 기준 안을 제시하였다(6). 이에 기초하여 먹는물 관련 법규들이 개정 혹은 신설되었으며 국립환경과학원에서 지정한 실험실에 의하여 수돗물 관련 원수 및 정수에 대한 감염성 바이러스 검사 제도가 수립되고 검사가 이어졌다. 2000년 초 국내에서 처음으로 미국 EPA에 의하여 대량의 원수 및 정수에 대한 감염성 바이러스 시험 결과가 보고되었다(7). 169건의 원수 및 정수에 대한 농축 시료를 검사한 결과 14건의 원수에서 감염성 바이러스가 확인되었다. 분리된 바이러스들은 콕삭키바이러스, 백신주로 추정되는 폴리오바이러스 등을 포함한 외막이 없는 엔테로(entero)바이러스들이 다수였다. 이 제도의 도입으로 인하여 우리나라에서는 한강의 지류천지류부터 유입되는 원수에 대한 감염성 바이러스 현황이 자세히 규명되고 있다.
2.4. 하수에서 코로나-19 RNA 검사 방법 개요
하수 내 코로나-19 RNA 검사를 위한 시료 농축 및 RT-PCR 수행에 관한 국제기구 혹은 국가 단위 표준 시험 방법은 아직 제정되지 않고 있다. 따라서 각국의 연구자들이 독자적인 방법으로 검사를 수행함에 따라서 코로나바이러스-19 방법들은 시험자에 따라서 구체적인 시험 방법에 차이가 있다. 하수 내 코로나바이러스-19 RNA 검사 방법의 개요는 다음과 같다(8). 하수 처리장 유입수 등에서 채취하는 방법은 WHO의 폴리오 검사 기준을 외막 보유바이러스에 맞게 수정하여 수행한다(9). 즉 하수처리장의 유입수 시료를 채취한 다음 즉시 ？20도C에 보관한다. 연구자들이 직접 시료에 대한 바이러스 시험을 수행하거나 해당 국가의 관련 기관에 송부하여 검사한다. 바이러스 핵산을 농축하기 전에 56℃에서 30분간 열처리로 통하여 바이러스의 감염성을 불활화한다. 시료 농축은 2상(two-phase) 즉 PEG-dextran 방법을 사용하여 이루어진다. 즉 250 ml의 하수 시료를 원심하여 하수의 고형을 침전한다. 투명한 하수를 덱스트란으로 혼합 후 혼합액을 별도의 패널에서 작용시킨다. 그런 후 밑층과 중간층을 취하고 이 농축액을 첫 원심으로부터 얻은 패널에 넣어서 바이러스 RNA를 추출한다. 분자 실험하기 전에 추출된 핵산에 대해서 가능한 PCR 저지물질들을 정제한다. 여러 종류의 nested RT-PCR 검사법과 하나의 real-time q-PCR 검사법을 사용하여 SARS-CoV-2의 존재 여부를 시험한다. PCR 생성물을 전기 영동으로 규명한 후, 정제한 시료를 서열분석 한다. 실험실들은 여건에 따라서 코로나바이러스의 핵산 분석을 위하여 임상진단제 용 상업 시약들을 사용하기도 한다. 필요 시에 PCR 생성물에 대한 확인시험을 수행한다.
3. 세계 주요 국가의 코로나바이러스-19 RNA 검사
3.1. 네덜란드에서 하수에서의 코로나바이러스-19 RNA 검사
Medema 등이 네덜란드에서 세계 최초로 하수에서 코로나바이러스-19 RNA 탐지를 등이 시도하였다(10). 네덜란드에서 이 바이러스 유행 초기에 도시들과 공항을 관장하는 정수처리장에서 코로나바이러스-19의 탐지 여부를 확인하기 위하여 시험을 수행하였다. 네덜란드의 2개 대형 도시와 3개의 중형 도시들 그리고 주요 공항 등을 관장하는 하수처리장에서 코로나바이러스-19 RNA 검사를 시작하였다. 첫 검사는 네덜란드에서 유행이 시작된 2월 27보다 3주 전인 2월 6일에 수행되었으며 이 시험에서 음성으로 확인되었다. 유행이 진전됨에 따라서 가장 많이 유행하는 지역 중의 하나를 가검물 채취 대상에 포함시켰다. 수거 방법은 WHO의 기준을 수행하여 이루어졌으며 RT-PCR 시험은 자체 제작한 시약을 사용하였다. 3월 15/16일에 6개 도시의 하수에서 N1 조각이 탐지되었으며 N3와 E 조각이 각각 5개 장소와 4개 장소에서 탐지되었다. 코로나감염증-19 유행이 낮은 시기에서도 하수에서 바이러스가 탐지된 사실은 하수 감시체계가 인구 중에 바이러스의 유행을 탐지할 수 있는 매우 높은 도구가 될 수 있음을 나타내고 있다.
3.2. 이탈리아에서 하수에서의 코로나바이러스-19 RNA 검사
이탈리아에서는 Rosa 등이 2020년 2월 3일에서 4월 2일까지의 기간에 밀란, 로마 등의 하수 처리장으로부터 12개 시료를 확보하여 코로나19 RNA의 존재 여부에 대해서 시험하였다(8). 12개 시험 시료 중에서 6건(50%)의 시료에서 코로나바이러스-19 RNA가 존재함을 확인하였다. 시험에서 채택한 RpRd 검사 방법은 스파이크(spike) 유전자를 표적으로 한 시험 방법 보다 감도가 높음을 보여주었다. Rosa 등이 사용한 핵산 탐지 방법은 WHO 방법보다는 탐지의 한계(limit of detection, LOD)가 낮은 것으로 추정되고 있다. 또한 시험을 수행함에 있어서 반드시 외부 대조를 두는 것이 필요한 것으로 조사되었다. 시료에 대한 열 처리 과정은 바이러스의 병원성을 낮출 것으로 추정되며 바이러스 탐지의 감도에는 큰 영향을 끼치지 않는 것으로 확인되었다. 새로이 디자인된 nested PCR 방법은 감염자의 스크린 목적으로 유용함을 발견하였다. 밀란의 하수에서 양성으로 시험되는 시기에는 실제 이 지역에서 임상적 환자가 29명으로 매우 적을 때이다. 따라서 하수에서 코로나바이러스19를 검사하는 방법은 지역에서의 유행을 조기에 탐지하는 방법으로 의미가 큰 것으로 평가된다.
3.3. 프랑스에서 하수에서의 코로나바이러스-19 RNA 검사
프랑스의 연구자들은 1개월 이상 파리(Paris) 광역구역의 하수에서 코로나바이러스의 증감을 탐지 시험하였다(11). 이 사실은 도시를 폐쇄하여 질병 전파를 차단하는 지역에서 발생하는 대규모COVID-19 유행에 대한 상응 조치의 하나로서 취해졌다. 여러 연구진들이 하수에서 코로나바이러스 탐지 사실을 보고해 오고 있으나 이 새로운 연구는 임상적 환자 증가가 폭발적으로 늘어나기 전에 수행된 하수에서의 바이러스 검사로서 실제 코로나-19 환자수 증가를 증명한 첫 사례였다(11). 이 방법은 가격이 저렴하고 임상적인 개별 검사에서 오는 불편을 해소할 수 있으며 2차 코로나19 파도를 예측할 수 있는 방법이라고 전문가들은 확신하고 있다. 하수에서 코로나바이러스-19 RNA 파편의 농도가 높으면 지역 내 감염자 수가 많음을 증명하는 방법을 택하고 있다. 프랑스에서는 3월 5일과 4월 7일 사이에 5개소의 파리-지역 하수처리장의 시료를 1주에 2회 채취하였다. 파리에서 소수의 코로나19로 인한 사망이 있기 수일 전에 이 지역 하수에서 RNA 파편 농도의 증가를 확인하였다.
3.4. 호주에서 하수에서의 코로나바이러스-19 RNA 검사
호주 퀸즈랜드 주의 1개 펌프 장과 2개의 하수처리장의 미처리 수에 대해서 시료를 채취하여 코로나바이러스-19 RNA를 검사하였다(12). 시료 채취는 검사의 감도를 높이기 위하여 다양한 방법을 택하였다. 시료 중의 바이러스를 탐지하기 위하여 Amed 등이 연구한 RT-qPCR 방법을 사용하였다. 검사의 정확도를 높이기 위하여 추출물에 존재할 수 있는 시험 억제물질들에 대한 시험을 수행하였으며 품질관리용 대조를 두었다. 분리되는 양성 생산물에 대해서 유전자 서열을 분석하였다. 시험에서 얻어지는 RNA 농도에 기반해서 해당 지역에서의 코로나바이러스-19 감염의 유병률을 추정하였다. 시험 결과 검사된 9개 시료 가검물 중에서 2개의 시료(22.2%)에서 코로나바이러스-19 RNA가 존재함을 확인하였다. 얻어지는 시료의 RNA 커피 수에 근거하여 해당 시기 중, 실제 감염자 수를 추산하는 연구들을 수행하였다. 즉 시험이 수행된 브리즈번 지역에서 감염 중간수는 1,071명에서 171명 범위의 유병률이 되는 것으로 추산하였다. 이 연구에서 가장 어려운 점은 호주에서 미처리수에서 확보되는 바이러스 농도를 사용하여 지역 내의 감염자 수에 대한 정확한 추산이었다.
3.5. 스페인 등에서 하수에서의 코로나바이러스-19 RNA 검사
Randazzo 등은 스페인 내의 6개 하수처리장에서 코로나바이러스-19 RNA 검사를 수행하였다. 대상 지역은 스페인의 이베리아에서 가장 감염자 수가 낮은 지역이었다(13). 대체바이러스를 사용하여 시료 농축 방법으로 수산화 알루미늄-흡수 침전 농축 방법의 효능을 시험하였다. 이 농축방법은 하수장의 유입수에서 10% 정도의 회수 효능을 그리고 배출 수에서는 평균 3% 정도의 회수 효율을 보였다. 이를 확인한 다음 2020년 3월 12일에서 4월 14일 사이에 하수처리장의 유입수에 대해서 코로나바이러스-19 RNA 검사를 수행하였다. N 유전자를 표적으로 하는 리얼타임 RT-qPCR 진단 패널을 사용하여 미처리 수에서 평균 5.4 유전체 카피수를 확인하였다. 2회에 걸친 2차 물 시료에서는 18건 중 2건에서 양성을 그리고 모든 3차 물 시료는 음성으로 시험되었다. 여러 상황을 종합적으로 분석하였을 때 검사 대상 지역의 구성원들은 지역에서 임상 환자를 보고하기 이전에 이미 분(stool)으로부터 코로나바이러스-19를 배출하는 것으로 규명되었다.
일본에서는 연구자들이 야마나씨 현의 5개 2차 처리장을 대상으로 하수 중의 CoV-19 RNA 존재 여부를 시험하였다(14). 시험 결과는 5개 하수처리장 중에서 1개 장소에서 코로나바이러스-19 RNA가 탐지되었으며 그 농도는 리터 당 2.4X103 커피수를 보였다. 물로부터의 시료들은 모두 음성으로 시험되었다. 이 기술의 의의와 중요성 그리고 CoC-19 RNA의 모니터링을 위한 제도 도입 등을 평가 중이다.
이상에서 기술한 국가 이외, 중국, 미국 등에서도 하수에서 코로나바이러스-19 RNA를 검사들이 수행된 것으로 알려져 있다.
4. 검토
최근의 한 연구에 의하면 SARS-CoV가 사람의 장에서 배출된 후에 분(stool)에서는 22일, 혈청 시료에서 16일, 그리고 기도에서 18일을 생존하는 것으로 보고되었다(15). 이는 CoV-19 바이러스가 하수 집하장에서 상당한 기간 동안 바이러스 혹은 RNA상태로서 존재할 수 있음을 나타내며 탐지 기술을 발전시키는 경우, 하수에서 상당 기간 동안 탐지할 수 있을 것으로 평가된다.
오래 전부터 하수 혹은 원수에 대한 바이러스 검사는 그 지역 사회의 사람에 대한 감염 상태는 물론이고 사람의 감염병에 크게 작용하고 있는 동물성 바이러스의 감염 분포도 파악할 수 있어 그 의미는 대단히 크다고 할 수 있다. 현재 유행이 진행 중인 코로나바이러스-19의 유행 양상에 대한 규명은 물론이고 사람에서 중요성이 커지고 있는 인플루엔자 A형을 비롯한 여러 종류의 간염 바이러스들 그리고 발암성 암 등 다양한 바이러스의 지역 유행에 관한 역학 연구를 위하여서도 큰 의의를 갖고 있다.
하수에 대한 바이러스 탐지 시험은 개별 임상 검사 방법에 앞서 감염병의 출현 탐지 여부를 조기에 파악함은 물론이고 지역에서 다수 바이러스의 유행에 대한 증감 여부를 규명하는 데에 가장 유용한 도구가 될 수 있다. 이번 코로19의 세계적 유행을 맞이하여 감염 규모와 유행의 증감을 정확히 빠른 시기에 규명하는 것은 지역적으로나 세계적으로 해결해야 할 우선 과제 중의 하나이다. 특정 국가 혹은 지역에서 코로나19 유행을 이른 시기에 탐지하기 위하여 개별적 임상 혹은 실험실 검사에 바탕 한 역학 조사는 엄청난 규모의 인력과 예산이 소요될 뿐만이 아니라 인권을 해치는 등의 현실적인 한계가 있다. 과학자들은 하수기반 역학을 사용하여 보다 저렴하고 효율적이며 짧은 시기에 유행의 규모와 특성을 규명하려는 노력을 하고 있다. 그러나 이 방법은 검사의 정확도와 아울러 감염인 추산에서 보다 정확도를 높여야 하는 과제를 안고 있다.
하수에서 바이러스 RNA를 시험하는 데에 있어서는 억제물질의 제거, 지역의 특이적인 온도에 의한 변수 등 여러 가지 지역 특이성 과제들을 갖고 있다. 또한 조사 대상 인구에 따른 다른 미생물과의 관련성, 지역 하수의 pH 등 여러 요인에 의하여 영향을 받고 있음을 고려해야 하며 이러한 문제들은 국가 혹은 지역에서 해결해야 할 과제이다.
5.결론
현재 유행하고 있는 코로나19의 유행은 일정 기간이 경과된 후 유행 수준이 낮아지거나 소멸될 것으로 전망된다. 이후에 거리두기 등 방역이 완화되는 경우, 코로나19의 유행이 재 출현할 수 있다. 근래 네덜란드를 비롯한 세계 10여개 국가에서 하수에 기반한 코로나바이러스-19의 탐지 기술이 개발되고 조기 탐지에 사용 가능성을 제시하고 있다. 그러나 현재로서는 이 기술을 보다 개선하여 감도와 특이도를 높이며 실제 감염자 수를 보다 정확히 추산할 수 있는 체제의 구축이 요구되고 있다. 또한 근래 각광을 받고 있는 인공지능(AI)기술을 이 시스템에 적용하는 경우, 보다 효율적이며 짧은 시간에 보다 정확한 감염자의 존재 여부는 물론이고 감염자 수의 증감 상태를 규명할 수 있을 것으로 예상된다.
특히 우리나라는 국립환경과학원에서2001년부터 수돗물 원수와 정수에 대한 감염성 바이러스 검사제도를 지속적으로 수행하고 있어서 하수 및 원수에 대한 바이러스 시험 능력이 축적되어 왔다. 이 검사 체제를 조절 혹은 보강하여 하수에 대한 코로나바이러스-19 RNA 검사 제도를 오입하는 경우, 국내에서의 여러 바이러스 감염증의 유행 양상에 대한 규명이 이루어질 것으로 예상된다. 나아가서 이 시스템의 보강은 코로나바이러스-19 이외 인플루엔자 등 다른 바이러스와 함께 간염바이러스, 암 유발 바이러스 등 다수 바이러스를 효율적으로 시스템의 운영이 가능할 것으로 판단된다. 이러한 제도가 성공하기 위하여서는 보건복지부, 환경부 및 지자체 등 정부의 여러 관계 기관이 협력하는 범부처 사업으로 이루어져야 할 것이다.
References
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2. Mallapaty, S., HOW SEWAGE COULD REVEAL TRUE SCALE OF CORONAVIRUS OUTBREAK. Nature, 580, 176-176, 2020
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4. 신영오 등, 바이러스표준분석방법 및 분석 인증제도 연구, 국립환경연구원 연구보고서 단행본, 2001년 12월 13일
5. Fout, Total Cuturable Virus Quantal Assay. US Environmental Protection Agency Published Report. 1999. Record ID: 63285
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9. Medema, G. Heijnen, L. Elsinga, G. et al. Presence of SARS-Coronavirus-2 in sewage. Reprint, 1-9, 2020
10. Leste-Lasserre, C., Coronavirus found in Paris sewage points to early warning system, Science, 21 April 2020
11. Ahmed, W., et al., First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater inAustralia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. Science of the Total Environment, 728, 1-8, 2020
13. Randazzo, W., Truchado P., Cuevas-Ferrando, E., SARS-CoV-2 RNA in wastewater anticipated COVID-19 occurrence in a low prevalence area. Water Research, 181, 1-8, 2020
14. Haramoto, E. First environmental surveillance for the presence of SARS -CoV-2 RNA in wastewater and river water in Japan. Science of the Total Environment, 2020, https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.140405
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신영오, yungoh@kangwon.ac.kr
한국산업기술진흥협회
Key words
CoVID-19, SARS-CoV-2, CoV-19 RNA in wastewater, early detection of CoV-19 emergence, prevention of CoV-19 pandemic, 코로나19, 코로나바이러스-19, 감염병 조기예보, 코로나19 유행의 조기탐지, 하수기반 역학
1. 개요
코로나19는 2019년에 중국에서 발생하여 2020년 6월 말 현재 219개 국가에서 거의 1 천만명의 환자와 50여만명의 사망자를 발생시키고 그 유행을 계속하고 있다. 우리나라는 1만3천여명의 확진자와 282명의 사망을 보이고 있으면서 낮은 수준의 유행이 계속되고 있다. 현재 코로나19의 방역에서 가장 큰 이슈 중의 하나는 이 유행이 끝난 후에 코로나바이러스―19의 출현을 빠른 시기에 찾아내는 일이다. 즉 최근에 보고된 역학 기술을 최대로 활용하는 것이 또 다른 피해를 최소화하는 길이다. 근래에 특정 지역에서의 감염자 유행을 조기에 발견하는 방법으로서 하수에 대한 코로나바이러스-19 RNA의 존재를 검사하는 방법들이 분자생물학적 방법과 통계학적 방법의 결합으로 개발되어 실제 이용되고 있다. 이 방법은 아직 여러 가지 보완의 필요성이 있으나 개선시키는 경우, 지역 내 유행의 조기 발견은 물론이고 감염 추세를 보다 정확하게 규명할 수 있는 것으로 조사되고 있다. 현재 전 세계적으로 10여개 국가가 하수기반역학(wasterwater based epidemiology)도구인 하수 내의 코로나바이러스-19 RNA의 존재를 보고하고 있어 이들 내용을 소개한다. 이와 관련하여 우리나라는 2000년부터 전국적으로 대형 정수장의 원수 및 처리 수에 대한 바이러스 검사를 제도적으로 시행해 오고 있다. 즉 수돗물 관련 원수에 대한 “총 배양성 바이러스”를 검사해 오고 있어 장내바이러스를 위주로 한 바이러스 종류와 그 수를 측정하는 검사 시스템을 갖고 있다. 따라서 이 제도에 코로나바이러스-19 RNA검사를 결합하여 코로나19 재유행의 조속한 탐지와 보다 정확한 유행 수준을 파악할 수 있을 것으로 판단된다. 국내에서도 코로나19 조기 발견을 위하여 지역인으로부터 배출되는 하수에 대한 조직적인 검사 제도의 도입, 시행을 제시한다.
2. 하수에서의 코로나바이러스-19 RNA 검사
2.1. 하수에서 코로나19 RNA 검사 방법의 필요성
코로나19는 발생이 시작된 이후 반년이 지난 지금에도 감염자, 환자 및 경제적 피해 등이 늘어나고 있다[1]. 그럼에도 불구하고 이번 팬데믹은 여러 국가들이 지역을 폐쇄(lock-down)하는 등의 강력한 조치들을 취하는 등 각종 역학적 조치들과 함께 감염병의 특성으로 인하여 종국적으로 기간의 차이는 있으나 감소 과정을 거쳐 유행이 종식될 것으로 예상된다. 그러나 유행이 끝난 이후 다시 코로나감염증-19 팬데믹의 출현, 혹은 재출현의 가능성은 상존하고 있다. 특정 국가나 지역에서 코로나-19의 유행을 최단기간 내에 탐지하는 방법으로 현재 사용하는 개별 의심자에 대한 열 측정, 임상 및 실험실 검사 방법은 매우 어려움이 수반된다. 개별검사 방법은 미증상 감염자와 잠복기 감염자가 바이러스를 배출하고 있음에도 불구하고 실제적으로 바이러스의 존재를 확인하기 어렵다. 또한 개별 임상 검사는 확진 과정과 보고 체계 등을 고려하면 하수 내 RNA 검사보다 7, 8일이 늦을 수 있어 조기 대응이 비효율적이다[2]. 즉 방역에서 치명적 시기를 넘기는 문제점을 갖고 있다. 근래 네덜란드 등 수개 국가의 연구자들이 이러한 코로나19의 출현, 재출현의 조기탐지를 위한 방법으로 하수 처리 공장에서 CoV19의 RNA를 탐지를 보고하였다[3]. 따라서 하수 내 바이러스 RNA 검사 방법을 도입하여 보다 빠른 시기에 새로운 유행을 찾는 방법의 이해와 도입이 필요하다.
2.2. 지역 하수 체계에서 코로나바이러스-19 RNA의 존재 확인
특정 지역에서 코로나바이러스-19 감염자가 발생하는 경우, 그 지역의 하수에서는 코로나19 RNA가 지속적으로 발견된다. 감염자의 분변으로부터 바이러스 배출 기간은 바이러스 감염 후 14-21일 동안이며 감염자에 따라서 차이가 많다. 배출되는 바이러스의 양은 분변 1 그람 당 102 내지 108까지의 RNA 사본(copy) 수를 보인다. 하수 등 환경에서 바이러스의 활성 유지는 온도, pH 값, 광선 및 소독제 등에 따라서 결정된다. 하수에서 외막이 있는 바이러스인 CoV를 처음으로 탐지한 것은 2013년 Wong들에 의하여 이루어졌다(4). 이들은 마이크로배열(microarray) 방법을 사용하여서 하수 시료 12 건 중, 1건의 시료에서 RNA를 탐지하였다. 2004년 사스 환자 입원 병원에서 확보된 소독 처리된 하수의 30%에서 사스바이러스 RNA가 탐지되었다. 프랑스에서는 처리 하수에서 리터당 106승 RNA 커피수를 보고하였다.
2.3. 우리나라 원수에서의 감염성 바이러스 시험
하수에서 바이러스 RNA를 참지하는 체계와는 별개로 우리나라에서는 수돗물 원수 등에 대한 감염성 바이러스 검사가 20여년 동안 이어지고 있다. 1999년 국내에서 인구의 다수가 사용하는 수돗물에서 감염성 상태의 바이러스가 유행성수막염 유행병의 원인이 된다는 주장이 제기되었다. 이에 대응하여 서울특별시, 국립환경연구원(원장: 류재근) 및 환경부(장관: 김명자) 등 관계 기관에서는 대한바이러스학회에 “수돗물 관련 바이러스표준분석방법 및 분석 인증제도 연구”를 의뢰하였다. 해당 학회에서는 미국 EPA의 “Total Culturable Virus Quantal Assay”(5) 및 일본 등 외국의 기준을 참고로 하여 기준 안을 제시하였다(6). 이에 기초하여 먹는물 관련 법규들이 개정 혹은 신설되었으며 국립환경과학원에서 지정한 실험실에 의하여 수돗물 관련 원수 및 정수에 대한 감염성 바이러스 검사 제도가 수립되고 검사가 이어졌다. 2000년 초 국내에서 처음으로 미국 EPA에 의하여 대량의 원수 및 정수에 대한 감염성 바이러스 시험 결과가 보고되었다(7). 169건의 원수 및 정수에 대한 농축 시료를 검사한 결과 14건의 원수에서 감염성 바이러스가 확인되었다. 분리된 바이러스들은 콕삭키바이러스, 백신주로 추정되는 폴리오바이러스 등을 포함한 외막이 없는 엔테로(entero)바이러스들이 다수였다. 이 제도의 도입으로 인하여 우리나라에서는 한강의 지류천지류부터 유입되는 원수에 대한 감염성 바이러스 현황이 자세히 규명되고 있다.
2.4. 하수에서 코로나-19 RNA 검사 방법 개요
하수 내 코로나-19 RNA 검사를 위한 시료 농축 및 RT-PCR 수행에 관한 국제기구 혹은 국가 단위 표준 시험 방법은 아직 제정되지 않고 있다. 따라서 각국의 연구자들이 독자적인 방법으로 검사를 수행함에 따라서 코로나바이러스-19 방법들은 시험자에 따라서 구체적인 시험 방법에 차이가 있다. 하수 내 코로나바이러스-19 RNA 검사 방법의 개요는 다음과 같다(8). 하수 처리장 유입수 등에서 채취하는 방법은 WHO의 폴리오 검사 기준을 외막 보유바이러스에 맞게 수정하여 수행한다(9). 즉 하수처리장의 유입수 시료를 채취한 다음 즉시 ？20도C에 보관한다. 연구자들이 직접 시료에 대한 바이러스 시험을 수행하거나 해당 국가의 관련 기관에 송부하여 검사한다. 바이러스 핵산을 농축하기 전에 56℃에서 30분간 열처리로 통하여 바이러스의 감염성을 불활화한다. 시료 농축은 2상(two-phase) 즉 PEG-dextran 방법을 사용하여 이루어진다. 즉 250 ml의 하수 시료를 원심하여 하수의 고형을 침전한다. 투명한 하수를 덱스트란으로 혼합 후 혼합액을 별도의 패널에서 작용시킨다. 그런 후 밑층과 중간층을 취하고 이 농축액을 첫 원심으로부터 얻은 패널에 넣어서 바이러스 RNA를 추출한다. 분자 실험하기 전에 추출된 핵산에 대해서 가능한 PCR 저지물질들을 정제한다. 여러 종류의 nested RT-PCR 검사법과 하나의 real-time q-PCR 검사법을 사용하여 SARS-CoV-2의 존재 여부를 시험한다. PCR 생성물을 전기 영동으로 규명한 후, 정제한 시료를 서열분석 한다. 실험실들은 여건에 따라서 코로나바이러스의 핵산 분석을 위하여 임상진단제 용 상업 시약들을 사용하기도 한다. 필요 시에 PCR 생성물에 대한 확인시험을 수행한다.
3. 세계 주요 국가의 코로나바이러스-19 RNA 검사
3.1. 네덜란드에서 하수에서의 코로나바이러스-19 RNA 검사
Medema 등이 네덜란드에서 세계 최초로 하수에서 코로나바이러스-19 RNA 탐지를 등이 시도하였다(10). 네덜란드에서 이 바이러스 유행 초기에 도시들과 공항을 관장하는 정수처리장에서 코로나바이러스-19의 탐지 여부를 확인하기 위하여 시험을 수행하였다. 네덜란드의 2개 대형 도시와 3개의 중형 도시들 그리고 주요 공항 등을 관장하는 하수처리장에서 코로나바이러스-19 RNA 검사를 시작하였다. 첫 검사는 네덜란드에서 유행이 시작된 2월 27보다 3주 전인 2월 6일에 수행되었으며 이 시험에서 음성으로 확인되었다. 유행이 진전됨에 따라서 가장 많이 유행하는 지역 중의 하나를 가검물 채취 대상에 포함시켰다. 수거 방법은 WHO의 기준을 수행하여 이루어졌으며 RT-PCR 시험은 자체 제작한 시약을 사용하였다. 3월 15/16일에 6개 도시의 하수에서 N1 조각이 탐지되었으며 N3와 E 조각이 각각 5개 장소와 4개 장소에서 탐지되었다. 코로나감염증-19 유행이 낮은 시기에서도 하수에서 바이러스가 탐지된 사실은 하수 감시체계가 인구 중에 바이러스의 유행을 탐지할 수 있는 매우 높은 도구가 될 수 있음을 나타내고 있다.
3.2. 이탈리아에서 하수에서의 코로나바이러스-19 RNA 검사
이탈리아에서는 Rosa 등이 2020년 2월 3일에서 4월 2일까지의 기간에 밀란, 로마 등의 하수 처리장으로부터 12개 시료를 확보하여 코로나19 RNA의 존재 여부에 대해서 시험하였다(8). 12개 시험 시료 중에서 6건(50%)의 시료에서 코로나바이러스-19 RNA가 존재함을 확인하였다. 시험에서 채택한 RpRd 검사 방법은 스파이크(spike) 유전자를 표적으로 한 시험 방법 보다 감도가 높음을 보여주었다. Rosa 등이 사용한 핵산 탐지 방법은 WHO 방법보다는 탐지의 한계(limit of detection, LOD)가 낮은 것으로 추정되고 있다. 또한 시험을 수행함에 있어서 반드시 외부 대조를 두는 것이 필요한 것으로 조사되었다. 시료에 대한 열 처리 과정은 바이러스의 병원성을 낮출 것으로 추정되며 바이러스 탐지의 감도에는 큰 영향을 끼치지 않는 것으로 확인되었다. 새로이 디자인된 nested PCR 방법은 감염자의 스크린 목적으로 유용함을 발견하였다. 밀란의 하수에서 양성으로 시험되는 시기에는 실제 이 지역에서 임상적 환자가 29명으로 매우 적을 때이다. 따라서 하수에서 코로나바이러스19를 검사하는 방법은 지역에서의 유행을 조기에 탐지하는 방법으로 의미가 큰 것으로 평가된다.
3.3. 프랑스에서 하수에서의 코로나바이러스-19 RNA 검사
프랑스의 연구자들은 1개월 이상 파리(Paris) 광역구역의 하수에서 코로나바이러스의 증감을 탐지 시험하였다(11). 이 사실은 도시를 폐쇄하여 질병 전파를 차단하는 지역에서 발생하는 대규모COVID-19 유행에 대한 상응 조치의 하나로서 취해졌다. 여러 연구진들이 하수에서 코로나바이러스 탐지 사실을 보고해 오고 있으나 이 새로운 연구는 임상적 환자 증가가 폭발적으로 늘어나기 전에 수행된 하수에서의 바이러스 검사로서 실제 코로나-19 환자수 증가를 증명한 첫 사례였다(11). 이 방법은 가격이 저렴하고 임상적인 개별 검사에서 오는 불편을 해소할 수 있으며 2차 코로나19 파도를 예측할 수 있는 방법이라고 전문가들은 확신하고 있다. 하수에서 코로나바이러스-19 RNA 파편의 농도가 높으면 지역 내 감염자 수가 많음을 증명하는 방법을 택하고 있다. 프랑스에서는 3월 5일과 4월 7일 사이에 5개소의 파리-지역 하수처리장의 시료를 1주에 2회 채취하였다. 파리에서 소수의 코로나19로 인한 사망이 있기 수일 전에 이 지역 하수에서 RNA 파편 농도의 증가를 확인하였다.
3.4. 호주에서 하수에서의 코로나바이러스-19 RNA 검사
호주 퀸즈랜드 주의 1개 펌프 장과 2개의 하수처리장의 미처리 수에 대해서 시료를 채취하여 코로나바이러스-19 RNA를 검사하였다(12). 시료 채취는 검사의 감도를 높이기 위하여 다양한 방법을 택하였다. 시료 중의 바이러스를 탐지하기 위하여 Amed 등이 연구한 RT-qPCR 방법을 사용하였다. 검사의 정확도를 높이기 위하여 추출물에 존재할 수 있는 시험 억제물질들에 대한 시험을 수행하였으며 품질관리용 대조를 두었다. 분리되는 양성 생산물에 대해서 유전자 서열을 분석하였다. 시험에서 얻어지는 RNA 농도에 기반해서 해당 지역에서의 코로나바이러스-19 감염의 유병률을 추정하였다. 시험 결과 검사된 9개 시료 가검물 중에서 2개의 시료(22.2%)에서 코로나바이러스-19 RNA가 존재함을 확인하였다. 얻어지는 시료의 RNA 커피 수에 근거하여 해당 시기 중, 실제 감염자 수를 추산하는 연구들을 수행하였다. 즉 시험이 수행된 브리즈번 지역에서 감염 중간수는 1,071명에서 171명 범위의 유병률이 되는 것으로 추산하였다. 이 연구에서 가장 어려운 점은 호주에서 미처리수에서 확보되는 바이러스 농도를 사용하여 지역 내의 감염자 수에 대한 정확한 추산이었다.
3.5. 스페인 등에서 하수에서의 코로나바이러스-19 RNA 검사
Randazzo 등은 스페인 내의 6개 하수처리장에서 코로나바이러스-19 RNA 검사를 수행하였다. 대상 지역은 스페인의 이베리아에서 가장 감염자 수가 낮은 지역이었다(13). 대체바이러스를 사용하여 시료 농축 방법으로 수산화 알루미늄-흡수 침전 농축 방법의 효능을 시험하였다. 이 농축방법은 하수장의 유입수에서 10% 정도의 회수 효능을 그리고 배출 수에서는 평균 3% 정도의 회수 효율을 보였다. 이를 확인한 다음 2020년 3월 12일에서 4월 14일 사이에 하수처리장의 유입수에 대해서 코로나바이러스-19 RNA 검사를 수행하였다. N 유전자를 표적으로 하는 리얼타임 RT-qPCR 진단 패널을 사용하여 미처리 수에서 평균 5.4 유전체 카피수를 확인하였다. 2회에 걸친 2차 물 시료에서는 18건 중 2건에서 양성을 그리고 모든 3차 물 시료는 음성으로 시험되었다. 여러 상황을 종합적으로 분석하였을 때 검사 대상 지역의 구성원들은 지역에서 임상 환자를 보고하기 이전에 이미 분(stool)으로부터 코로나바이러스-19를 배출하는 것으로 규명되었다.
일본에서는 연구자들이 야마나씨 현의 5개 2차 처리장을 대상으로 하수 중의 CoV-19 RNA 존재 여부를 시험하였다(14). 시험 결과는 5개 하수처리장 중에서 1개 장소에서 코로나바이러스-19 RNA가 탐지되었으며 그 농도는 리터 당 2.4X103 커피수를 보였다. 물로부터의 시료들은 모두 음성으로 시험되었다. 이 기술의 의의와 중요성 그리고 CoC-19 RNA의 모니터링을 위한 제도 도입 등을 평가 중이다.
이상에서 기술한 국가 이외, 중국, 미국 등에서도 하수에서 코로나바이러스-19 RNA를 검사들이 수행된 것으로 알려져 있다.
4. 검토
최근의 한 연구에 의하면 SARS-CoV가 사람의 장에서 배출된 후에 분(stool)에서는 22일, 혈청 시료에서 16일, 그리고 기도에서 18일을 생존하는 것으로 보고되었다(15). 이는 CoV-19 바이러스가 하수 집하장에서 상당한 기간 동안 바이러스 혹은 RNA상태로서 존재할 수 있음을 나타내며 탐지 기술을 발전시키는 경우, 하수에서 상당 기간 동안 탐지할 수 있을 것으로 평가된다.
오래 전부터 하수 혹은 원수에 대한 바이러스 검사는 그 지역 사회의 사람에 대한 감염 상태는 물론이고 사람의 감염병에 크게 작용하고 있는 동물성 바이러스의 감염 분포도 파악할 수 있어 그 의미는 대단히 크다고 할 수 있다. 현재 유행이 진행 중인 코로나바이러스-19의 유행 양상에 대한 규명은 물론이고 사람에서 중요성이 커지고 있는 인플루엔자 A형을 비롯한 여러 종류의 간염 바이러스들 그리고 발암성 암 등 다양한 바이러스의 지역 유행에 관한 역학 연구를 위하여서도 큰 의의를 갖고 있다.
하수에 대한 바이러스 탐지 시험은 개별 임상 검사 방법에 앞서 감염병의 출현 탐지 여부를 조기에 파악함은 물론이고 지역에서 다수 바이러스의 유행에 대한 증감 여부를 규명하는 데에 가장 유용한 도구가 될 수 있다. 이번 코로19의 세계적 유행을 맞이하여 감염 규모와 유행의 증감을 정확히 빠른 시기에 규명하는 것은 지역적으로나 세계적으로 해결해야 할 우선 과제 중의 하나이다. 특정 국가 혹은 지역에서 코로나19 유행을 이른 시기에 탐지하기 위하여 개별적 임상 혹은 실험실 검사에 바탕 한 역학 조사는 엄청난 규모의 인력과 예산이 소요될 뿐만이 아니라 인권을 해치는 등의 현실적인 한계가 있다. 과학자들은 하수기반 역학을 사용하여 보다 저렴하고 효율적이며 짧은 시기에 유행의 규모와 특성을 규명하려는 노력을 하고 있다. 그러나 이 방법은 검사의 정확도와 아울러 감염인 추산에서 보다 정확도를 높여야 하는 과제를 안고 있다.
하수에서 바이러스 RNA를 시험하는 데에 있어서는 억제물질의 제거, 지역의 특이적인 온도에 의한 변수 등 여러 가지 지역 특이성 과제들을 갖고 있다. 또한 조사 대상 인구에 따른 다른 미생물과의 관련성, 지역 하수의 pH 등 여러 요인에 의하여 영향을 받고 있음을 고려해야 하며 이러한 문제들은 국가 혹은 지역에서 해결해야 할 과제이다.
5.결론
현재 유행하고 있는 코로나19의 유행은 일정 기간이 경과된 후 유행 수준이 낮아지거나 소멸될 것으로 전망된다. 이후에 거리두기 등 방역이 완화되는 경우, 코로나19의 유행이 재 출현할 수 있다. 근래 네덜란드를 비롯한 세계 10여개 국가에서 하수에 기반한 코로나바이러스-19의 탐지 기술이 개발되고 조기 탐지에 사용 가능성을 제시하고 있다. 그러나 현재로서는 이 기술을 보다 개선하여 감도와 특이도를 높이며 실제 감염자 수를 보다 정확히 추산할 수 있는 체제의 구축이 요구되고 있다. 또한 근래 각광을 받고 있는 인공지능(AI)기술을 이 시스템에 적용하는 경우, 보다 효율적이며 짧은 시간에 보다 정확한 감염자의 존재 여부는 물론이고 감염자 수의 증감 상태를 규명할 수 있을 것으로 예상된다.
특히 우리나라는 국립환경과학원에서2001년부터 수돗물 원수와 정수에 대한 감염성 바이러스 검사제도를 지속적으로 수행하고 있어서 하수 및 원수에 대한 바이러스 시험 능력이 축적되어 왔다. 이 검사 체제를 조절 혹은 보강하여 하수에 대한 코로나바이러스-19 RNA 검사 제도를 오입하는 경우, 국내에서의 여러 바이러스 감염증의 유행 양상에 대한 규명이 이루어질 것으로 예상된다. 나아가서 이 시스템의 보강은 코로나바이러스-19 이외 인플루엔자 등 다른 바이러스와 함께 간염바이러스, 암 유발 바이러스 등 다수 바이러스를 효율적으로 시스템의 운영이 가능할 것으로 판단된다. 이러한 제도가 성공하기 위하여서는 보건복지부, 환경부 및 지자체 등 정부의 여러 관계 기관이 협력하는 범부처 사업으로 이루어져야 할 것이다.
References
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