RNA 간섭을 활용한 치료제 개발의 최근 연구 동향
RNA 간섭을 활용한 치료제 개발의 최근 연구 동향
추헌수, chuhunsu@gmail.com
(주) 로펠바이오
Key words
RNA interference, Central dogma, Sense RNA, Anti-sense RNA, Double stranded RNA, small interfering RNA
RNA 간섭, 중심원리, 센스 RNA, 안티센스 RNA, 이중가닥 RNA, 짧은 간섭 RNA
1. 개요
최근 들어 RNA 간섭(RNAi, RNA interference)에 대한 관심이 크게 증가하고 있다. 이는 단순히 생명 현상에 대한 관심이 늘어난 것에 기인하기 보다 그 기술의 발전으로 이를 이용한 치료제의 개발이 빠르게 이루어지고 있기 때문이다. 1998년 처음으로 예쁜꼬마선충(C.elegans)에 관한 연구에서 정립된 RNA 간섭 현상은 이후 여러 고비를 넘기며 최근에 하나씩 간 및 신경질환 치료제로 개발되고 있다. 질병의 원인을 단백질 수준에서 분석하고 이를 막는 것이 아니라, 단백질이 만들어지기 이전 단계인 RNA 수준에서 파악하고 이를 제거함으로써 질병을 치유하거나 발생을 억제하겠다는 발상은 DNA에서 RNA, 그리고 다시 RNA에서 단백질로 이어지는 중심원리(central dogma)를 고려해보면 매우 합리적이다. 하지만, 이를 치료제로 개발하기까지 처음 이 개념이 알려진 뒤로 거의 20여년의 기간이 필요했다.
이 보고서에서는 RNA 간섭 현상의 정의와 이를 치료제로 개발하기 까지의 노력들을 간단하게 살펴보고자 한다. 이와 더불어 이 현상을 치료제로 응용하는데 필요한 이 기술의 한계점과 이를 극복하려는 노력, 그리고 최근의 치료제 개발 현황에 대해 살표보고자 한다. 관련 기술과 산업 전반에 걸친 개괄적인 리뷰는 개개의 연구자들이 자신의 연구에 대한 위치와 역할에 대해 진지한 고민을 해 볼 수 있도록 도와줄 수 있을 것이다.
2. 주요 내용
2.1. RNAi 란
RNA 간섭 현상을 처음 알게 된 1998년 이전부터 여러 연구진이 RNA에 대한 많은 연구들을 진행하고 있었다. 그 중 Guo와 Kemphues는 mRNA와 동일한 염기서열을 지니고 있는 센스 RNA(sense RNA)를 주입하거나 안티센스 RNA(anti-sense RNA)를 주입해도 모두 해당 유전자의 발현이 억제되어 단백질이 만들어지지 않는다는 사실을 발견해 학계에 많은 논란을 불러 일으킨 바 있다[1]. 당시 연구자들의 생각으로는 안티센스 RNA를 주입하는 경우만, 해당 유전자의 발현이 억제될 것으로 예측했기 때문이다. 하지만, 이러한 논란은 1998년, 미 카네기 연구소의 Fire와 MIT의 Mello가 실시한 실험에 의해 다시 증명되었다. 이들은 이러한 논란에 대한 메커니즘을 밝히기 위해 예쁜꼬마선충(C.elegans)의 unc-22라는 근섬유 단백질 유전자를 표적으로 센스 RNA, 안티센스 RNA, 그리고 이중가닥 RNA(double stranded RNA)를 주입하고 해당 유전자의 발현 여부를 관찰했다. 그들은 그 결과 이중가닥 RNA를 주입한 경우 unc-22의 발현을 100% 억제할 수 있으며 센스 RNA나 안티센스 RNA를 주입한 것에 비해 그 효과가 훨씬 뛰어나다는 사실을 밝혀낼 수 있었다. 그들은 이를 RNA 간섭(RNAi)라 명명했다.
이후 이어진 많은 연구를 통해, 이중가닥 RNA를 체내에 주입한 경우 Dicer라는 리보핵산 가수분해효소에 의해 21-23bp의 작은 크기의 RNA로 분해된다는 사실이 밝혀졌고, 이들 작은 크기의 RNA를 siRNA(short interfering RNA)로 명명하기로 했다. 이 siRNA들은 세포 내의 RISC라 불리는 세포내 RNA유도억압체와 결합해 이중가닥이 풀려 한 가닥만 RISC내에 존재하게 되고, 이 siRNA가 세포 내에서 상보적으로 완벽하게 일치하는 mRNA와 결합하게 되면 Argonaute라는 단백질 인자가 표적 mRNA를 자르면서 유전자의 발현이 억제된다.
2.2. RNAi 치료제의 원리
유전자가 발현되어 단백질이 만들어지는 과정에는 반드시 RNA를 거치게 되므로 RNA에서 단백질이 만들어지는 번역(translation)과정을 방해해 특정 유전자의 발현이 이루어지지 않게 만들거나 특정 mRNA를 주입하여 단백질의 발현이 원활하게 이루어지도록 돕는 방식으로 질병 관련 단백질을 조절하는 것이 바로 RNAi 치료제의 원리이다.
많은 경우, 특정 유전자의 과발현으로 질병이 발생하는 경우가 많으며, 이때는 앞서 설명한 RNAi를 이용해 그 유전자의 발현을 억제하여 질병을 치료하는 방법이 있고, 질병과 관련한 어떤 특정 유전자의 발현이 저해되었거나 정상적인 유전자의 발현이 제대로 이루어지지 않아 질병이 발생하는 경우 그 단백질의 번역 전 mRNA를 삽입하여 정상적인 단백질 발현이 이루어지고 이를 이용해 질병이 생기는 것을 억제하는 방법으로 RNAi 치료제가 개발되고 있다. 하지만, 대부분의 경우 특정 유전자의 발현을 억제하는 방향으로 치료제가 개발되고 있는 것이 일반적이다.
치료에 이용되는 RNA는 크게 siRNA(short interfering RNA)와 microRNA로 구분할 수 있다. siRNA의 경우 타겟이 설정되면 이 타겟의 염기서열을 분석해 특정한 이중가닥 RNA를 제작하고, 이를 세포 내에 주입하게 되면 상보적인 서열을 가지고 있는 특정 mRNA에 결합하여 그 mRNA를 분해하는 역할을 수행하게 된다. microRNA의 경우 합성이 아닌 원래 지닌 유전체의 유전정보에서 유래해 이미 존재하는 경우가 대부분이며, 연구자들이 이를 발견한 경우 RNAi 치료제로 이용이 가능하다. 이들 microRNA는 대부분 이중나선을 구성하고 있는 hairpin RNA로부터 유래하는 경우가 많으며, mRNA에는 완전하게 매칭(matching)이 되어야 하는 것이 아니라 일부분만 염기서열이 일치해 매칭되어도 해당 유전자의 발현을 억제하는데 이용될 수 있다. 많은 연구를 통해 마이크로RNA가 최초로 발견된 예쁜꼬마선충에는 약 200여 개의 마이크로RNA 유전자가 있으며, 사람의 경우 2000여 개가 발견된 바 있다.
크게 보면 siRNA의 경우 mRNA의 절단 및 제거에 초점을 맞추고 있다면, miRNA(microRNA)의 경우는 단백질의 발현을 조절하는데 초점이 맞추어 있다(대부분이 단백질 발현의 억제이기는 하지만)고 볼 수 있다. 크기에 있어서도 siRNA와 miRNA는 차이가 있는데, siRNA가 20nt 정도의 길이라면 miRNA의 경우는 8nt 안쪽의 크기인 것들이 대부분이며 siRNA가 특정 mRNA 하나를 타겟으로 하는 것에 비해 miRNA는 다수의 타겟을 대상으로 존재한다는 차이가 있다.
이렇게 치료제 자체가 siRNA든 miRNA든 준비가 된 후에는 특정한 전달체를 통해 원하는 위치로 운반되게 된다. 2006년 Fire와 Mello가 예쁜꼬마선충에서 RNA 간섭현상을 통해 노벨상을 수상한 이후, 많은 글로벌 제약사들이 이를 이용한 치료제 개발에 열을 올리게 되었으나, 결과적으로 엄청난 경제적 손실을 낸 후 관련 연구 분야는 크게 위축되게 되었다. 그 이유는 이때만 해도 원하는 위치에 이 RNA 치료제를 전달하는 효과적인 전달시스템이 개발되지 않았기 때문이다. 그 침체기를 거쳐 다시 RNA 간섭 현상을 이용한 치료제가 각광을 받고 있는 이유는 바로 새로운 여러 약물전달체의 개발에 힘입은 바가 크다. 현재는 각종 나노입자(nanoparticle), 지질 나노입자(Lipid nanoparticle) 및 여러 기능성 화합물에 RNA치료제가 중합(conjugate)된 형태, 및 엑소좀(exosome)을 이용하거나 항체(antibody) 및 앱타머(aptamer)가 결합된 형태의 다양한 운반체가 이용되고 있다.
2.3. RNAi 치료제의 시장
RNA 치료제와 관련된 여러 전문회사의 설립과 이들에 의한 연구개발, 그리고 이들 전문기업과 글로벌 제약사들 간의 기술이전 및 공동연구를 통해 RNA 치료제 분야는 연평균성장율(CAGR)이 31%에 이를 정도로 급속도로 성장하고 있으며 이 중 RNAi 치료제 시장은 2022년 올해 60억 달러에서 2025년에는 110억 달러에 이를 정도로 크게 성장할 전망이다[2]. 이러한 성장에는 관련 RNA 연구가 지속적으로 투자를 받아 이루어지고 있다는 사실과 약물 후보군으로 이용될 수 있는 RNA 스크리닝 전문업체의 출현과 관련 기술의 개발도 크게 기여하고 있다.
아직까지 관련 산업분야는 시장진입 및 기술진입 장벽이 큰 것으로 파악되고 있는데, 이는 RNA 자체가 매우 불안정하기 때문이다. 실제 DNA나 단백질에 비해 단일가닥으로 존재하는 RNA의 경우 다양한 경로로 분해되기 쉬어 매우 불안정하고, 이로 인해 약물개발 대상에서 매력적이지 못하다는 문제가 있었다. 따라서 RNA 치료제 분야는 RNA가 지닌 불안정성을 잘 제어할 수 있는 기술력을 지닌 기업이 살아남을 수 있으며 이로 인해 진입 장벽이 높다. 하지만, 장기적인 관점에서 중심원리의 최종 산물인 단백질을 제어하기 보다 그 앞 단계 산물인 RNA를 조절하는 방법이 보다 효과적일 수 있다는 점에서 그 접근 방법은 긍정적으로 평가받고 있다.
2021년까지, siRNA치료제 현황을 살펴보면 이미 출시된 제품이 등록된 건을 포함해 4건이며, 임상3상을 진행중인 것이 4건, 임상2상은 15건, 임상1상은 11건이 진행중에 있고, 전임상 단계에 있는 후보물질은 60여건에 이르는 것으로 보고되고 있다. 이 중에서 현재 FDA 승인을 받아 의약품으로 판매되고 있는 것은 3건이며 모두 앨라일람(Alnylam Pharmaceuticals)에서 개발한 것들이다. 이들은 각각 유전성 ATTR 아밀로이드증 치료에 이용되고 있는 온파트로(Onpattro, 2018년), 급성 간성 포르피린증 치료제로 이용되고 있는 기브라리(Givlaari, 2019년), 원발성옥살산뇨증(PH1) 치료제로 이용되고 있는 옥슬루모(Oxlumo, 2020년)로 모두 FDA 승인 후 환자들의 치료를 위해 사용되고 있다[3].
관련 시장은 현재, 거대 글로벌 제약회사들이 siRNA 전문 기업들과의 제휴 및 공동 연구를 통해 크게 성장해가고 있다. 미러스바이오(Mirus)는 화이자(pfizer)와 siRNA RNA 기술과 관련한 공동 연구를 진행중에 있으며 SR pharma 역시 화이자와 나이 관련 황반변성(age related macular degeneration) 연구를 사노피(sanofi)와 다중 siRNA 치료에 관한 공동 연구를 진행 중에 있다. 이 외에도 Sirna는 글락소스미스클라인(gsk) 및 머크(Merck)와, 앨라일람은 노바티스와 각각 공동 제휴를 통해 다양한 siRNA 치료제를 개발 및 생산하고 있다.
2.4. RNAi 치료제의 한계
(1) 전달효율(transfer efficiency)
정맥주사를 통해 주입되는 siRNA는 혈중에서 핵산내부 가수분해효소(endonuclease)나 핵산외부 가수분해효소(exonuclease)에 의해 분해되기도 하고 신장 여과(renal clearance)를 통해 제거되기도 하며, 췌장에서 옵소닌 작용에 의해 RES/MPS에 인식되어 제거되기도 한다. 일반적으로 약물이 빠르게 배출되거나 분해되는 경우 의약품으로서의 기능을 수행하기 어렵고, 이러한 이유로 전달효율이 떨어져 RNAi 치료 효능이 떨어지는 경우가 많다.
(2) 세포 투과성(Cytopermeability)
siRNA가 투여되어 세포질에서 타겟으로 하는 mRNA와 결합하기 위해서는 우선 세포막을 통과하는 과정을 거쳐야 한다. 이 외에도 내포작용(endocytosis)을 통해 세포 내부로 들어오는 경우 내포(endosome)에서 빠져나와 세포질로 유입되는 절차를 거쳐야 한다. 일반적으로 siRNA의 경우 표면 음전하(40-50개의 음전하) 때문에 세포막을 통과하는 과정이 어렵기 어렵기 때문에 치료 효능이 떨어질 수밖에 없고, 이러한 이유로 RNAi 치료제의 전달체는 세포 투과성이 개선된 형태로 발전해왔다.
(3) 부정확한 영향(Off-target effects)
타겟을 명확히 결정하고 합성된 형태의 siRNA도 중간에 존재할 수 있는 타겟 이외의 mRNA에 결합해 이상반응을 일으킬 수 있다. 더구나 생명체의 체내에 존재하는 miRNA의 경우 원래 다수의 타겟에 동시에 결합할 수 있기 때문에 원하는 부위의 원하는 mRNA가 아닌 다른 타겟에 결합해 이상 반응을 유발하기도 한다. 일반적으로 합성을 위한 siRNA의 설계에 BLAST와 Smith-Waterman 분석과 같은 다양한 알고리즘이 도입되었지만, RNAi 치료의 부정확한 영향(off-target effect)을 완전히 제거할 수는 없다.
(4) 면역원성(Immunogenicity)
앞서 언급한 RNAi 치료제의 한계를 극복하기 위해 여러 형태의 전달체를 이용해 RNAi 치료제의 타겟으로 치료제를 전달한다. 이들은 일반적으로 체내에서 존재하는 형태의 것을 이용하는 경우(ex. 엑소좀)도 있으나, 대부분이 나노입자를 이용하거나 기능성 화합물과의 공유결합을 통해 전달되는 경우가 많아 이들 주입물에 대한 면역반응이 일어날 수 있는 위험성을 안고 있다. 따라서, 혈액과 전달체가 섞이면서 면역반응 유발하는 것을 예방하기 위해서 전달체가 포함된 RNAi 치료제는 투약 전에 스테로이드를 복용해야 하는 경우가 많다.
2.5. RNAi 치료제의 한계 극복
(1) RNAi 스위치(RNAi switch)
현재 사용 중인 RNA 치료제는 한번 투여할 경우 타겟 주위나 혹은 주변 지역에 원하는 효과를 나타내든 원치 않는 부작용을 나타내든 수 주 동안 지속적인 효과를 나타내도록 설계되어 있다. 긍정적이고 기대했던 효과라면 문제가 크기 않겠지만 부작용이 생기는 경우라면 이를 제어할 수 있는 장치가 필요하며, 이를 통해 주입한 RNAi의 활성을 억제할 수 있어야 한다. 이 경우, 투약한 siRNA의 안티센스 가닥의 일부 염기서열과 상보적인 염기서열을 가진 염기 가닥을 투약할 수 있으며 이를 통해 siRNA의 길항제(antagonists)개발이 가능하다. 부작용을 유발하는 RNAi 치료제의 활성을 제어하는 RNAi 스위치의 개발은 RNAi 치료제의 활성만큼이나 환자 개개인의 안전을 위해 중요하다.
(2) 엑소좀(Exosome)
엑소좀은 세포가 세포 외부로 방출하는 운반체의 하나로 진핵 생물체에서 세포 간의 정보 교환을 위해 방출하는 나노미터 크기의 물질을 말한다. 체내에 이미 존재하고 있는 운반체이기에 다른 RNAi 운반체인 나노입자 기반의 운반체와 달리 면역반응이 일어날 가능성이 거의 없기에 안전한 운반체로 분류될 수 있다. 엑소좀은 세포 표면에 존재하는 CD47 수용체가 자신의 표면에 존재하는 여러 리간드들과 쉽게 결합하기 때문에 세포 내로 쉽게 유입될 수 있다는 장점을 지니고 있으며 이로 인해 RNAi 치료제가 결합되어 있는 상태에서도 체내 반감기가 길어질 수 있다는 특징이 있다. 최근들어, 지질나노입자 이외의 대안으로 엑소좀에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
최근 항암 타겟으로 주목받고 있는 KRAS 돌연변이를 siRNA로 치료하는데 엑소좀을 활용한 사례가 보고된 바 있으며 전이성 췌장암 동물모델을 대상으로 한 실험에서 암세포의 크기가 줄고 실험동물의 생존율이 증가한다는 결과를 얻을 수 있었다[4]. 또한, EngEX 라는 엑소좀 플랫폼 기술을 보유하고 있는 엑소좀 전문기업인 Codiak Bioscience가 이 기술을 바탕으로 M. D. Anderson에서 임상이 진행되고 있는 이 iExosomes 기술을 2천만달러~1.5억 달러 규모로 인수해 화제가 되기도 했다. 하지만, 엑소좀의 경우 나노입자와 달리 대량생산이 어렵다는 점에서 이 부분에 대한 기술적인 문제가 먼저 해결될 필요가 있다.
(3) 항체 및 앱타머
부작용을 줄인 상태에서 원하는 곳에 정확하게 RNAi 치료제를 전달하기 위해 RNAi 치료제에 항체를 부착하는 연구도 활발하게 진행중에 있다. IgG 항체는 체내에서 전신순환(system circulation)을 하기 때문에 타겟의 위치가 어느 곳이든 적용이 편리하고 Fc-FcRn 결합을 통해 재순환(recycling) 및 세포통과(transcytosis)과 용이하다는 장점이 있다. 그 외에도 단백질 의약품을 제조하는 과정에서 찾을 수 있었던 여러 타겟 항체를 결합시켜 RNAi 치료제에 응용하는 연구도 활발하게 진행 중이다. 또한, 항체 이외에 RNAi 치료제에 앱타머(aptamer)를 결합시켜 치료제의 전달 효율을 증가시키려는 노력도 지속적으로 진행 중에 있다.
2.6. RNAi 치료제의 산업 동향
앞서 언급한 바와 같이 최근 RNAi 치료제 분야에 글로벌 제약사들의 참여가 크게 증가하고 있다. 실제로 최근의 RNAi 치료제의 기술 라이선스 거래 동향을 살펴보면 17년 2건, 18년 5건, 19년 4건, 20년 4건으로 계속해서 증가하고 있으며, Alnylam, Dicerna, Arrowhead pharmaceuticals를 중심으로 siRNA 치료제 파이프라인들이 글로벌 빅파마들에 기술 이전되고 있음을 알 수 있다[5].
관련 국내 기업으로는 에스티팜, 올리패스, 올릭스 등이 RNAi 치료제 개발에 많은 노력을 기울이고 있다. 구체적으로 에스티팜은 RNA 치료제 원료인 올리고뉴클레오타이드 (Olioneucleotide) API 로 사업을 확장하고 있다. 올리패스의 경우 체내 안전성 및 우수한 세포 투과성을 보유한 O PNA 플랫폼 기술을 바탕으로 관절염 치료제, 당뇨성 망막증 치료제, 뇌질환 등에 대한 RNAi 치료제 개발을 진행 중에 있다. 그리고 올릭스의 경우도 GalNAc 플랫폼 기술 확보 후 비대흉터 치료제인 OLX101이 임상에서 좋은 성적을 올리는 등 관련 기술 개발에 매진하고 있다. 특히, 올릭스는 GalNAc 과 염기를 연결하는 Linker 기술에 초점을 맞추어 글로벌 제약사들과의 협업을 진행 중에 있다[6].
3. 결론
2006년 노벨상을 수상한 이래로 RNAi 치료제에 대한 연구는 많은 투자가 뒤따랐고 그에 따른 연구 결과들도 속속 보고된 바 있다. 하지만, 이를 상업화하기에는 많은 무리가 뒤따랐으며 약물 전달체 분야의 기술 부족으로 다시 암흑기를 맞이하고 말았다. 하지만 최근 문제가 되었던 세포 투과성이나 전달 효율의 증가, 면역반응을 일으키지 않는 전달체의 개발 등으로 다시금 글로벌 제약사들의 관심을 끌고 있고 이를 뒷받침할 수 있는 많은 기술이전 및 협업 등이 이루어지고 있다.
현재까지의 RNAi 치료제는 간에 대한 치료체 개발에 국한된 면이 없지 않아 있다. 이는 관련 분야의 선두주자인 앨라일람의 GalNAc 플랫폼이 간을 타겟으로 하고 있기 때문이며 많은 후속 주자들이 GalNAc 플랫폼을 변형시킨 약물전달 플랫폼을 보유하고 있기 때문이다. 하지만 최근에는 이 또한 다양한 전달체의 개발로 신장, 안과 질환, CNS (Central nervous system) 질환 등에 대한 임상 시험도 진행되고 있다. RNAi 분야는 실질적으로 모든 유전자의 발현을 억제시킬 수 있기 때문에 기존의 저분자 의약품 항체 의약품으로 접근할 수 없는 타겟 단백질의 기능을 조절할 수 있다. 따라서 치료제가 없는 난치성 질환에 대한 새로운 해결책이 될 수 있으며, 이들 분야에 대한 집중적인 연구로 RNAi 치료제가 다시 무대의 중심에 설 수 있을 것으로 기대된다.
References
1. https://www.ksakosmos.com/, 2019.
2. RNAi for Therapeutic Applications: Technology and Market Forecast 2015-2025, https://www.visiongain.com/report/rnai-for-therapeutic-applications-technology-and-market-forecast-2015-2025/
3. http://www.biospectator.com/view/news_view.php?varAtcId=12252, 2021.
4. Kamerkar, S. et al., Exosomes Facilitate Therapeutic Targeting of Oncogenic Kras in Pancreatic Cancer. Nature 546(7659), 498-503, 2017.
5.http://www.koreabio.or.kr/cms/cmsView.do?menu1=8&menu2=2&type1=4&viewCheck=true&bbsseq=46898&bbsid=bbs9, 2021.
6.htps://www.samsungpop.com/common.do?cmd=down&saveKey=research.pdf&fileName=2020/2020030508410843K_01_04.pdf&contentType=application/pdf, 2020.