신약 개발을 위한 세포 투과 펩타이드(CPP)의 기전과 전망
신약 개발을 위한 세포 투과 펩타이드(CPP)의 기전과 전망
추헌수, chuhunsu@gmail.com
(주) 로펠바이오
Key words
Cell-penetrating peptide, Endosome, Central dogma, Endocytosis, Gene expression
세포 투과 펩타이드, 엔도솜, 중심원리, 내포작용, 유전자 발현
1. 개요
지난 수 십년 간의 약물 개발사를 살펴보면 70-80년대의 화학물질 기반의 의약품(chemical drug)들이 주류를 이루었다면 지금은 단백질 의약품(protein drug)의 시대라 할 수 있다. 물론 최근 DNA 나 RNA 기반의 치료제가 소개되고 많은 글로벌 기업들이 차세대 의약업계의 명운이 달려있는 주요한 테마로 기대되고 있지만, 아직 해결해야할 기술적인 과제들이 산재해 있다. 그래서 아직은 단백질 의약품의 시대라 할 수 있고, 지금도 새로운 단백질 의약품이나 이들을 전달할 수 있는 전달체를 중심으로 많은 기술적 발전을 이루어 치료제가 없거나 부족한 부분에 대한 단백질 치료제의 개발이 이루어지고 있다.
단백질은 인체에서 일어나는 많은 생리적 작용을 담당하는 역할을 하며 중심원리(central dogma)의 최종 산물이다. 치료제로 사용되는 단백질은 일반적으로 외부에서 체내로 주입되는 형태로 응용되는 경우가 많고, 이 경우 단백질이 면역반응을 일으킬 가능성이 적고 높은 표적 특이성을 지닌다는 장점이 있지만, 단백질 특유의 복잡한 구조와 활성을 잃거나 구조적 변화가 발생하는 경우 오히려 심각한 부작용을 지닌다는 단점도 지니고 있다. 뿐만 아니라, 단백질이 지닌 세포막 비투과성으로 인해 원하는 단백질 치료제를 세포막을 통과해 타겟에 정확하게 전달하는 문제도 해결해야 한다. 이러한 노력 중의 하나로 제시되는 방법이 바로 세포 투과 펩타이드 (cell-penetrating peptide, CPP)를 이용하는 것이다.
이 리포트에서는 현재 연구되거나 개발되고 있는 세포 투과 펩타이드에 관해 살펴볼 예정이다. 세포 투과 펩타이드의 개발과 관련한 역사를 살펴보고 현재 이루어지고 있는 세포 투과 펩타이드의 개발 현황을 살펴본다면 관련 연구 분야의 흐름을 전체적으로 파악하는데 도움을 줄 수 있을 것이다.
2. 주요 내용
2.1. 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide, CPP)란
세포 투과 펩타이드(이하 CPP)는 일반적으로 세포의 세포막을 통과해 세포질이나 핵에 도달할 수 있는 기능을 수행하는 펩타이드를 의미한다. 보통 10~30 개 정도의 아미노산으로 이루어져 있으며 양이온성(cationic)을 지닌 것, 양친매성(amphipathic), 소수성(hydrophobic) 등의 각기 다른 물리화학적 성질을 지닌 것들이 있다. 1988년, human immunodeficiency virus (HIV)의 Tat transactivator나 Drosophila melanogaster의 전사인자인 Antennapedia (Antp)가 처음 발견되었고, 그 이후 non-natural 펩타이드에서도 CPP들이 발견되어 왔다[1].
대부분 외부로부터 유입되는 물질은 세포로 유입될 때, 엔도솜(endosome)에 의해 감싸져 있다 라이소솜(lysosome)에 의해 분해되어 세포질에 흡수되는 경로를 따르게 되나, 내포작용(endocytosis)에 의해 세포 내로 유입된 CPP는 엔도솜을 빠져나가 분해되지 않고 세포내로 유입되는 경로를 따르게 된다.
2.2. CPP의 종류와 특징
CPP는 짧은 길이의 아미노산으로 구성되어 있으나 그 서열과 길이는 CPP에 따라 다양하다. 하지만 대부분이 염기성 아미노산(basic amino acid)인 경우가 많다. 처음 CPP가 발견된 것들을 찾아보면 대부분 자연계에 존재하는 것들이 많으며 차츰 그 특징을 적용해 인공적으로 제작한 CPP들도 개발되기 시작했다. 그 종류로는 HIV-1 Tat protein에서 유래한 pTAT(염기서열: YGRKKRRQRRR), HSV-1 structural protein에서 유래한 VP22(염기서열: DAATATRGRSAASRPTERPRAPAR-SASRPRRPVD), Drosophila melanogaster Antennapedia 유래의 Penetratin(염기서열: RQIKIWFQNRRMKWKK), Chimeric galanin-mastoparan 유래의 Transportan(염기서열: GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL), Chimeric SV40 T antigen sequence-Tryptophan-rich cluster 유래의 Pep-1(염기서열: KETWWETWWTEWSQPKKKRKV), Azurin 유래의 p28(염기서열: LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD), Bombyx mori 30Kc19 유래의 Pep-c19(염기서열: VVNKLIRNNKMNC) 등이 있으며 화학적으로 합성한 Poly-arginine(염기서열: Rn), Low molecular weight protamine (LMWP) (염기서열: VSRRRRRRGGRRRR) 등 50여개 이상의 CPP들이 보고되고 있다[2].
대표적인 CPP인 pTAT는 감염된 세포에서 HIV-1의 전사 및 복제를 유도하는 전사인자로 알려져 있으며 이 아미노산 서열 중 RKKKRRQRRR이 CPP 역할을 수행하는 핵심 서열이라고 보고된 바 있다. 또한 이를 연구하던 중 염기성 아미노산의 일종인 아르지닌(arginine)과 라이신(lysine)이 CPP가 세포내로 투과하는데 핵심적인 역할을 수행한다는 사실을 알 수 있었다[3]. 또한 HIV-1의 구성 요소중 하나인 VP22의 35개 아미노산을 세포 투과성이 없는 GFP와 결합시켰을 때 GFP에 세포 투과성이 생겨났으며 노랑초파리의 단백질 중 하나인 antennapedia (Antp) 단백질의 16개 아미노산 서열이 세포 투과성에 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀져 Penetratin으로 명명되었다[4]. 이 외에도 자연적으로 발견된 CPP로 누에에서 발견되는 단백질에서 유래한 Pep-c19 등이 보고된 바 있으며 이를 바탕으로 인공적으로 합성한 CPP도 다양하게 보고된 바 있다.
신호전달 펩타이드인 galanin과 G-단백질 활성화 기능을 갖는 mastoparan 펩타이드의 일부 아미노산을 각각 결합시킨 Transportan과 10개 내외의 아르지닌으로 구성된 Poly-arginine 등이 대표적인 인공합성 CPP로 보고되고 있다[5].
2.3. CPP의 투과 메커니즘
일반적으로 세포 외부의 물질이 세포 내부로 유입되는 경로는 직접적으로 투과되는 방식과 ATP를 사용하는 내포작용(endocytosis)로 구분될 수 있다. 이와 관련한 많은 초기 연구와 우여곡절이 있었지만, 아직 명확하게 모든 기전이 밝혀진 것은 아니며 일부 극소수의 CPP가 세포막으로 직접 투과되는 것으로 확인되었고, 나머지 대부분의 CPP는 ATP를 사용하는 내포작용을 통해 세포 내부로 투과되는 것으로 알려져 있다.
기본적으로 분자량이 200달톤(Dalton)이상이며 친수성을 띄는 물질은 세포 내로 직접 투과하지 못하는 것으로 알려져 있다. 하지만 여러 연구 들에서 강한 양이온성을 지니며 소수성 부위가 존재하는 CPP가 고농도로 존재할 때 세포막을 직접 투과하는 것으로 보고되었으며, 이에 대한 모델로 뒤집힌 미셀(inverted micelle) 모델과 카펫 유사(carpet-like) 모델 등이 제시된 바 있다. 어느 경우이든, 직접 투과되는 형태의 CPP는 보고는 되고 있으나, 실험 상의 문제나 불명확한 증거들로 인해 CPP의 주요한 세포막 투과 방식은 아닌 것으로 인식되고 있다.
이와 대조적으로, 이후의 많은 연구들을 통해 CPP가 ATP를 소모하는 내포작용을 통해 세포막을 투과한다는 증거가 속속 제시되었다. 세포 밖의 물질이 세포막과 만나 막으로 싸여 세포 내로 들어오는 작용을 내포 작용이라고 하는데, 이는 수용체 연관 내포 작용과 대음세포작용 (micropinocytosis), 그리고 caveolae 내포 작용으로 구분된다[2,6]. 이와 관련된 여러 실험 결과, 가장 대표적인 CPP의 하나인 pTAT에 GST 혹은 GFP가 연결된 물질의 경우 주로 caveolae 내포작용에 의해 세포 내로 들어가는 것으로 밝혀졌으며, pTAT 자체나 Tat-HA2의 경우 대음세포작용에 의해 세포 내로 수송되는 것으로 드러났다[7, 8].
어떠한 방식이든 세포막을 통과한 CPP들은 분해되는 것을 피하기 위해 엔도솜(endosome)으로부터 탈출을 해야 하며, 이 경우 양이온을 나타내는 CPP가 음이온을 나타내는 엔도솜과 강하게 결합해 막불안정성을 유도하고 이를 통해 탈출을 한다는 이론과 엔도솜의 성숙 과정에서 일어나는 내부 산성화에 의해 탈출한다는 이론이 제시된 바 있다[2,9].
2.4. CPP를 이용한 치료제 개발
현재까지 CPP를 이용해 다양한 종류의 기능성 단백질(β-galactosidase, eGFP, Bcl-xL, human catalase, human glutamate dehydrogenase, Cu, Zn-superoxide dismutase, NF-κB inhibitor srIκBα, HSP70)과 결합시켜 세포에 적용한 연구 결과들이 많이 보고되고 있다.
(1) 항암치료제 개발
항암제의 전달체로 사용되는 CPP는 penetratin, p28, 및 pTAT 등 다양한 CPP를 이용한 연구결과가 보고되고 있다. 이 경우 치료제 역할을 하는 펩타이드 혹은 화학물질을 CPP에 결합시켜 주입함으로써 CPP-치료제가 타겟으로 하는 곳에서 항원제시세포(antigen presenting cell)의 세포질에 도달할 수 있도록 함으로써 MHC를 거쳐 세포독성 T세포(cytotoxic T cell)가 정확한 타겟을 인지한 후 암세포를 공격할 수 있도록 도와주는 역할을 하게 된다. 실제, penetratin+ ovalbumin 유래 펩타이드를 치료제로 동물실험을 수행한 결과 CD4+와 CD8+ T 세포가 활성화되었고 그 결과 종양의 성장이 줄어들어 실험동물의 생존율이 향상된 바 있다[2,10]. 또한 p28의 경우 자체적으로 CPP의 역할을 하며 p53의 분해를 억제하는 역할을 하여 여러 동물실험에 적용되어 좋은 성과를 올린 바 있으며 pTAT와 p53과 상호작용하는 펩타이드를 치료제로 결합한 형태의 주입물도 뛰어난 암 억제 효능을 지닌 것으로 보고되었다[11].
(2) 신경계 질환 치료제
RNAi 치료제를 비롯해 많은 최신의 신약 개발 기술들이 신경조절과 관련된 질환의 치료를 위해 연구되고 있다. 이와 더불어 그러한 신약들을 원하는 타겟으로 전달하는데 중요한 전달체에 관한 연구도 많이 이루어지고 있으며 그 중 하나로 세포를 투과해 치료제를 전달할 수 있는 CPP에 대한 연구도 집중되고 있다. 일련의 연구자들이 세포 사멸을 막아주는 억제인자인 Bcl-XL에 pTAT와 엔도솜 탈출을 위한 HA-2 펩타이드를 결합한 치료제를 실험 동물에 투여한 결과 세포사멸이 억제되었음을 보여준 바 있고[12], 또 다른 연구에서는 신경 전구세포의 생존과 분화를 촉진하는 neurogenin-2에 CPP를 결합해 대뇌의 허혈성 재관류 손상을 개선한 바 있다[13].
이 이외에도 알츠하이머나 파킨슨병과 같은 신경질환 치료에도 성장인자인 FGF1을 CPP에 결합한 실험 결과가 보고된 바 있다. 관련 치료에 대해 RNAi 치료제의 전달체 개발의 가장 큰 문제인 혈액-뇌-장벽(blood-brain barrier, BBB)을 통과하는 문제를 CPP를 이용하여 해결할 수 있는 가능성도 커지고 있어 관련 치료제와의 연계 개발로 큰 발전이 예상되기도 한다.
(3) 줄기세포 분화 조절
앞서 언급한 신경계 질환의 치료에도 신경발달에 영향을 미치거나 혹은 이를 저해하는 인자를 제거하기 위한 목적으로 다양한 인자들이 CPP에 결합한 치료제에 대한 연구가 진행되었다. 이와 유사한 방법으로 줄기세포의 분화와 관련이 있는 성장인자들을 CPP에 결합시킨 여러 치료제에 대한 연구도 진행중이다. 일련의 연구진이 조골세포 성장인자인 Runx2에 CPP의 하나인 poly-arginine을 결합시킨 치료제를 실험동물에 주사해 조골세포의 성장을 확인한 바 있으며[14], 여러 개의 전사인자(Oct4, Sox2, cMyc, Klf4)를 하나의 poly-arginine에 결합시켜 실험 쥐의 섬유아세포를 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)로 분화시킨 연구결과도 보고되었다[15].
(4) 효소 전달
특정 효소의 부족이나 과잉으로 인해 발생할 수 있는 질병을 치료하거나 활성 산소를 제거할 목적의 전달체로 CPP를 이용하기도 한다. 한 연구진은 미토콘드리아에서 아미노산이나 탄소화물의 대사에 관여하는 효소인 Lipoamide dehydrogenase (LAD)를 pTAT을 결합해 LAD결핍 실험동물에 주입한 결과 다양한 조직에서 LAD의 활성을 증가시키는데 성공한 바 있으며[16], frataxin이라는 유전자의 변형으로 생기는 질환인 Fredreich ataxia를 치료하기 위해 재조합 frataxin을 CPP에 결합시켜 미토콘드리아의 기능을 회복시킨 연구결과도 보고되었다[17]. 또 다른 연구진은 pTAT이 결합된 SOD 재조합 단백질을 세포에 처리하였을 때 산화스트레스에 의한 세포 사멸이 유의미하게 감소하였고 이를 동물 모델에 적용해 허혈성 뇌 손상에 따른 뇌세포의 사멸이 억제되었음을 보여주었다[2, 18].
2.5. CPP개발 산업계 동향
현재 전세계적으로 개발 중이거나 혹은 개발된 CPP는 840여개에 이른다. 하지만 대부분의 CPP가 아직은 환자들의 실제 치료에 보고되고 있는 사례가 거의 없다. 이는 CPP가 바이러스에서 추출되었거나 인위적으로 합성된 펩타이드이기 때문에 심각한 독성문제를 유발할 수 있기 때문이다. 따라서 이들의 사용화를 위해서는 인간 단백질 유래 약물 전달 펩타이드, 뛰어난 투과성, 독성에 대한 안전성 등이 해결되어야 할 것이다.
전세계적으로 많은 벤처 및 산학기반 연구소 및 대학 소재 연구소 등에서 새로운 CPP에 관한 많은 연구가 이루어지고 있다. 이들 대부분은 작은 규모의 연구단이나 기업 등에서 이루어지고 있으며 이와 관련된 전문 기술이 축적되면 여러 방법의 치료제 개발 회사와의 공동연구나 투자, 기술 이전의 방식으로 실제 치료제로 개발되지 위한 절차를 거치게 된다. 국내의 경우도 이와 유사한 양상을 보인다.
2011년 코스닥에 상장한 나이벡은 CPP 기술개발 기업으로 자신들이 개발한 뇌혈관장벽 투과 전달체 기술인 ‘NIPEP-TPP-BBB셔틀’ 기술을 이용해 일본 제약회사인 다이치산쿄와 공동연구개발을 진행하기로 2021년 10월 발표했다. 또한 쎌트로이는 CPP 플랫폼을 개발해 류마티스 관절염, 급성심근경색 치료제 개발에 이용하려 하고 있으며 CPP(hph-1, Sim2)의 또다른 플랫폼을 기반으로 신약 파이프라인을 구축할 준비를 하고 있다. 또, 에이조스바이오는 인공지능을 이용한 CPP 개발을 진행하고 있으며, 특히 ABDP® (AZothBio Biomedical Delivery Platform)를 RNA 치료의 전달체로 활용할 계획을 세우고 있다.
3. 결론
최근 개발이 진행 중인 다양한 단백질 혹은 올리고 뉴클레오타이드 및 RNA 치료제들은 그 뛰어난 효과에도 불구하고 반드시 이를 원하는 타겟에 정확하게 전달시킬 수 있는 안전한 운반체가 필요하다. 현재 다양한 전달체로 사용중인 나노입자나 다양한 형태의 변형 나노입자(lipid nanoparticle)들은 그 전달 효율과 별개로 그 자체의 독성으로 인해 면역반응을 일으킨다는 문제가 있다. 이러한 여러 장애물을 극복할 수 있는 하나의 방안으로 제시되는 것이 바로 CPP를 이용한 치료제의 전달이다.
물론 아직 넘어야할 산이 많다. CPP의 종류에 따라 세포막을 통과하는 효율도 다르고 그 정확한 기전을 아직 알지 못하고 있다. 또한 같은 CPP라고 할지라도 세포 간의 결합력에 따른 세포막 투과율이 다르기도 하다. 이에 더해 세포막을 성공적으로 통과했더라도 엔도솜에 갇혀 탈출하지 못하고 분해되는 양이 많다는 단점도 해결이 되어야 한다. 그럼에도 불구하고 CPP는 자연적으로 존재하는 것들이 많고 다른 운반체에 비해 독성이 덜하며 전달효율 역시 뛰어나다는 장점이 있으므로, 관련 연구들이 보다 집중되어야 할 것으로 보인다.
CPP가 가지는 운반체로서의 다양한 기능과 그 자체로서 치료제의 기능을 수행할 수 있는 새로운 CPP의 발견은 관련 분야의 기술적 성숙도를 높이는데 기여하고 있으며 이들이 정확한 목표로 전달될 수 있다면 앞으로 CPP의 응용 분야는 셀 수 없을 정도로 크다 하겠다.
References
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