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지식나눔

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ChIP assay해보신 분 있으시면 도와주셨으면 합니다.

2004-10-16 org.kosen.entty.User@5c638dff 문재희(jaihi)
  • 2
얼마전부터 ChIP assay를 하고 있는데..전체적으로 PCR을 했을 때 band가 보이지 않더라구요..혹시 해보신 분이 있으시다면 어떻게 하셨는지 알려주실 수 있으신가요? Upstate에서 판매되고 있는 제품을 사용헀습니다.
  • ChIP
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답변 2
  • 답변

    전주홍님의 답변

    2004-10-17
    • 0
    문제 해결과 직접 연결이 될 지는 모르겠습니다. 1. Formaldehyde에 대해서 착각하고 계시는 분들을 가끔씩 볼 수 있습니다. 35-40% formaldehyde solution을 formalin이란 상품으로 파는 경우가 많습니다. 그래서 10% Formalin solution은 4% Formaldehyde solution과 같은 말이죠. 물론 Formaldehyde는 aldehyde group에 의해 chemical cross-linking을 유도하여 fixing 시키는 agent인데 self-cross-linking이 상당히 일어나기 때문에 보통 stock solution에는 methanol을 집어 넣어서 이를 억제하고 있습니다. Diluted solution은 이를 유의할 필요도 있습니다. 2. Sonication 조건이 중요한 문제 중의 하나이기 때문에 조건을 setting 할 필요가 있습니다. 3. Antibody의 quality 문제인데 ip가 잘되는 antibody인지가 중요하겠죠. Polyclonal Ab면 IP에는 크게 문제가 안될 수 있지만 Specificity가 문제가 될 수도 있구요, Monoclonal antibody의 경우, single epitope을 가지기 때문에 만약 target protein이 지닌 epitope이 다른 단백질과의 결합을 통해 가려지게 되면 IP에 문제가 되는 경우가 종종 발생합니다. 그래서 IP 자체는 문제가 없는 Ab인지 확인이 필요합니다. 4. PCR product의 size도 문제인데 Formaldehyde로 cross-linking을 했기 때문에 DNA 그 자체도 어느정도 cross-linking이 되어 있습니다. 그렇기 때문에 PCR product의 size가 작게 나오게끔 primer를 design해야 pcr반응이 잘 일어나겠죠. 그리고, PCR polymerase를 어느 회사것을 사용하느냐도 또 다른 선택중의 하나겠죠... 도움이 될 지는 모르겠습니다. Genomics. 2004 Mar;83(3):349-60, ChIP-chip: considerations for the design, analysis, and application of genome-wide chromatin immunoprecipitation experiments Methods. 2002 Jan;26(1):27-36.Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation. 이 논문도 참고하시면 좋을 듯한데 제가 PDF 파일이 없어서 못올려서 죄송합니다. 하시는 일 잘 되시길 바랍니다.
    답변수정
    문제 해결과 직접 연결이 될 지는 모르겠습니다. 1. Formaldehyde에 대해서 착각하고 계시는 분들을 가끔씩 볼 수 있습니다. 35-40% formaldehyde solution을 formalin이란 상품으로 파는 경우가 많습니다. 그래서 10% Formalin solution은 4% Formaldehyde solution과 같은 말이죠. 물론 Formaldehyde는 aldehyde group에 의해 chemical cross-linking을 유도하여 fixing 시키는 agent인데 self-cross-linking이 상당히 일어나기 때문에 보통 stock solution에는 methanol을 집어 넣어서 이를 억제하고 있습니다. Diluted solution은 이를 유의할 필요도 있습니다. 2. Sonication 조건이 중요한 문제 중의 하나이기 때문에 조건을 setting 할 필요가 있습니다. 3. Antibody의 quality 문제인데 ip가 잘되는 antibody인지가 중요하겠죠. Polyclonal Ab면 IP에는 크게 문제가 안될 수 있지만 Specificity가 문제가 될 수도 있구요, Monoclonal antibody의 경우, single epitope을 가지기 때문에 만약 target protein이 지닌 epitope이 다른 단백질과의 결합을 통해 가려지게 되면 IP에 문제가 되는 경우가 종종 발생합니다. 그래서 IP 자체는 문제가 없는 Ab인지 확인이 필요합니다. 4. PCR product의 size도 문제인데 Formaldehyde로 cross-linking을 했기 때문에 DNA 그 자체도 어느정도 cross-linking이 되어 있습니다. 그렇기 때문에 PCR product의 size가 작게 나오게끔 primer를 design해야 pcr반응이 잘 일어나겠죠. 그리고, PCR polymerase를 어느 회사것을 사용하느냐도 또 다른 선택중의 하나겠죠... 도움이 될 지는 모르겠습니다. Genomics. 2004 Mar;83(3):349-60, ChIP-chip: considerations for the design, analysis, and application of genome-wide chromatin immunoprecipitation experiments Methods. 2002 Jan;26(1):27-36.Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation. 이 논문도 참고하시면 좋을 듯한데 제가 PDF 파일이 없어서 못올려서 죄송합니다. 하시는 일 잘 되시길 바랍니다.
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  • 답변

    박진아님의 답변

    2004-10-19
    • 0
    positive에서 band가 잘 나오고 sample에서만 문제가 생긴다면.. 우선, 무엇보다고 Ab가 chip grade 인지 살펴보시고... 그래도 뭔가 있는데 눈으로 잘 안보인다면 realtime PCR을 해보세요. 간혹 PCR할때 isotope을 섞어 증폭하여 signal을 보는 방법도 있으나 realtime이 효과적입니다. >얼마전부터 ChIP assay를 하고 있는데..전체적으로 PCR을 했을 때 band가 보이지 않더라구요..혹시 해보신 분이 있으시다면 어떻게 하셨는지 알려주실 수 있으신가요? >Upstate에서 판매되고 있는 제품을 사용？습니다.
    답변수정
    positive에서 band가 잘 나오고 sample에서만 문제가 생긴다면.. 우선, 무엇보다고 Ab가 chip grade 인지 살펴보시고... 그래도 뭔가 있는데 눈으로 잘 안보인다면 realtime PCR을 해보세요. 간혹 PCR할때 isotope을 섞어 증폭하여 signal을 보는 방법도 있으나 realtime이 효과적입니다. >얼마전부터 ChIP assay를 하고 있는데..전체적으로 PCR을 했을 때 band가 보이지 않더라구요..혹시 해보신 분이 있으시다면 어떻게 하셨는지 알려주실 수 있으신가요? >Upstate에서 판매되고 있는 제품을 사용？습니다.
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