2005-02-16
org.kosen.entty.User@4cc05f50
이현정(dydfla)
- 4
안녕하세요...
알고싶은게 있어 이렇게 글을 올립니다.
제가 하는 실험이 yeast two hybrid system을 이용하여 cDNA library로부터 target protein을 찾는 것인데요.. 실험을 통해 target protein이라고 interaction한다는 target을 몇개 찾았거든요.
그것을 prep하여 sequencing을 맡겼는데 제대로 읽지 못하네요,,
sample 48개를 보내면 그 중에서 제대로 읽혔다고 얘기하는게 한 10개 정도,,, 나머지는 200bp밖에 못 읽는데요..
그래서 sequencing이 안 될 조건들을 전부 배제시켜 제대로 해서 sample을 보냈는데도 결과는 마찬가지입니다. ㅠㅜ (우울해요~)
sequencing 결과가 좋지 않아 blast search를 해도 match되는게 대부분 chromosome이고,,,,
그래서 말인데요..
blast search할 때 700bp정도의 사이즈가 아니라 한 200~300bp를 search할려고 하는데 NCBI blast search말고 다른 search site는 없나요?
NCBI에서 short sequence란 옵션을 선택해도 결과는 위에서 말씀드린대로 거의 다 chromosome으로 나오거든요...
실험은 거의 다 해놓고 결과 분석이 안 되니 정말 답답하기 그지없습니다.
short sequence를 효과적으로 blast search할 수 있는 사이트나 방법을 알려주세요... 그럼 빠른 답변 기다리겠습니다.
좋은 하루 되시구요,,, 눈,비 와서 약간 쌀쌀한데 감기조심하세요^^*
- sequencing analysis
- blast search
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답변 4
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답변
박인영님의 답변
2005-02-16- 0
1) 일반적으로 yeast에서 바로 prep하면 sequencing을 비롯한 DNA 조작 실험들이 잘 안될 겁니다. PCR product로 맡기거나 E.coli로 옮겨서 prep하시면 좀 나을 겁니다. 2) Blast button 바로 위의 “Choose Database“에서 'nr'로 하지마시고, est_human(human이면) 등을 선택하세요.. 그래서 걸린 est를 가지고 다시 하시면 됩니다.. 3) Blast search 시 size에는 관계가 없습니다. 오히려 길게하면 길게할수록 잡다한 것이 덜 잡히죠.. 길게 그냥 하세요.. 4) 제가 알기로는 Blast가 최고입니다. -
답변
김용주님의 답변
2005-02-16- 0
안녕하세요. 고민이 많으시겠습니다. 혹시 도움이 될지 몰라 www.expasy.ch를 소개 해드립니다. 링크된 툴들이 많이 있습니다. 그리고, 생물정보학 교과서 등에서 추천하는 대체 프로그램으로는 PSI-BLAST, FASTA, SSEARCH, BLAT등이 있습니다. 제가 구글로 검색해 본 바 쉽게 각 사이트들을 찾아 가실 수 있습니다. 실마리를 찾으실 수 있기를..... -
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전주홍님의 답변
2005-02-16- 0
200 bp 정도면 NCBI Blast에서 충분히 찾을 수 있는 길이 입니다. Automatic sequencing이 일반화 되기전에 저는 Sanger method로 sequencing해서 100 bp-150 bp 로 search했거든요... 요즘 AH109 strain은 굉장히 powerful하지요... 특히 X-alpha-Gal은 specificity가 좋죠... 그런데 일단 Two-hybrid에서 잡은 클론의 서열이 gene 서열의 일부만 있다고 생각하기는 힘듭니다. 1) 아마 BAC 클론이 잡혀나오는 것 같은데요... Search하실 때 EST로 한정해서 해 보시는 것도 괜찮을 것 같은데요... 2) Library라는게 genomic DNA contamination이 일부되기도 하죠... library Quality도 중요하죠... 또한 plasmid library amplification을 몇번 거쳤다면요...(저는 개인적으로 mating 방법을 선호합니다... diversity에 대한 coverage도 좋고 해서...) 3) Y2H 해서 확인해 보면 엉뚱한 sequence 들이 translation되어 interaction 한다고 나오는 경우가 많죠...예를 들면 UTR sequence인데 인위적으로 translation되어 positive 결과가 나오는 경우가 많죠... 4) 잡아낸 클론의 ORF를 잘확인하셔서 translation을 시킨 후 단백질 수준에서 search를 할 수도 있습니다. 조금 더 discussion을 했으면 좋겠네요... 하시는 일 잘 되시길 바랍니다... >안녕하세요... >알고싶은게 있어 이렇게 글을 올립니다. >제가 하는 실험이 yeast two hybrid system을 이용하여 cDNA library로부터 target protein을 찾는 것인데요.. 실험을 통해 target protein이라고 interaction한다는 target을 몇개 찾았거든요. >그것을 prep하여 sequencing을 맡겼는데 제대로 읽지 못하네요,, >sample 48개를 보내면 그 중에서 제대로 읽혔다고 기하는게 한 10개 정도,,, 나머지는 200bp밖에 읽는데요.. >그래서 sequencing이 안 될 조건들을 전부 배제시켜 제대로 해서 sample을 보냈는데도 결과는 마찬가지입니다. ㅠㅜ (우울해요~) >sequencing 결과가 좋지 않아 blast search를 해도 match되는게 대부분 chromosome이고,,,, >그래서 말인데요.. >blast search할 때 700bp정도의 사이즈가 아니라 한 200~300bp를 search할려고 하는데 NCBI blast search말고 다른 search site는 없나요? >NCBI에서 short sequence란 옵션을 선택해도 결과는 위에서 말씀드린대로 거의 다 chromosome으로 나오거든요... >실험은 거의 다 해놓고 결과 분석이 안 되니 정말 답답하기 그지없습니다. >short sequence를 효과적으로 blast search할 수 있는 사이트나 방법을 알려주세요... 그럼 빠른 답변 기다리겠습니다. > >좋은 하루 되시구요,,, 눈,비 와서 약간 쌀쌀한데 감기조심하세요^^* > > -
답변
최인걸님의 답변
2005-02-20- 0
1. 제일 먼저 해야할일은 좀더 깨끗한 DNA를 가지고 정확한 서열을 얻어내는 것 같습니다. (앞서 여러분들의 답변 참조) 2. 지금 가지고 있는 짧은 염기서열이라도 (정확하다면), 염기서열검색보다는 'BlastX' 같은 단백질 서열검색을 해보시길 (제대로된 염기서열이라면 단백질 coding region이 나올것임) 바랍니다. 짧은 염기서열로 염기서열 데이터베이스검색은 노이즈가 많이 나올수 있습니다.