지식나눔

Protein 정량법 좀 알려주세요.

Western을 하기 위해 protein을 정량하려고 하는데 지금까지는 Gel에 loading을 해서 band의 밝기정도를 보고 판단했는데 하면서 늘 느끼던 것이 너무 오차가 클 것 같다는 느낌과 너무 시각에만 의존해서 부정확할 것 같다는 생각이 들었습니다. 그래서 표준 용액 곡선 방법인 Bradford 시약과 BSA를 가지고 spectrophotometer를 찍어봤는데 자꾸 층이 나뉘어 지면서 spec값이 아예 나오질 않네요... ELISA를 사용하는 방법 외엔 Protein정량 하는 방법이 없는지... 여러분이 사용하는 정량법은 어떤 것들이 있는지 좀 알려주시겠어요?^^; 그럼 좋은 하루 마감하세요....('ㅡ')/
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답변 3
  • 답변

    전주홍님의 답변

    학위과정 때 Protein Methods란 책의 내용을 기반으로 정리해 놓은 것인데 한번 참고해보세요...“Protein Methods“는 단백질 관련 실험 내용을 쉽게 잘 정리해 놓은 책이니 참고해 보세요... 그리고 용어상에서 ELISA를 사용하는 방법이라는 표현을 조금 어색한 것 같습니다. Microtiter plate format으로 단백질 정량분석을 하시는 것 같은데 아마 사용하시는 plate가 ELISA용 plate이거나 분석기기가 ELISA reader이겠지요... 1. Absorbance at 280nm (A280) 1) advantage - direct, rapid, nondestructive method 2) disadvantage - not strictly quantitative (strong absorbance of tyrosine, phenylalanine, and tryptophan residues / varying extinction coefficients of different proteins) - strong interference by nucleic acid 3) detection range : 0.2 - 2mg/ml (~0.05mg/0.1ml) 4) typical use : generating a protein elution profile after column chromatography 2. Bradford assay 1) advantage - rapid (10min), sensitive (little protein must be sacrificed) - few interfering substances 2) disadvantage - some variability in response between different purified proteins, unstable end product - proteins irreversibly denatured 3) detection range : 25-200μg/ml (2.5μg/0.1ml) 4) comment - color development : fully developed after 5min precipitation start : 10 -15min (acidic condition에서 protein은 ppt하려는 경향이 있기 때문에 고농도에서 더욱 ppt가 잘 일어남) 3. Lowry assay 1) advantage - reliable method, little variation among different proteins 2) disadvantage - many interfering substances, slow reaction rate, instability of certain reagents, proteins irreverisbly denatured 3) detection range : 5μg/ml - 100μg/ml 4) comment - color development : maximum in 20 -30min gradual loss of signal at about 1%/hr - problem : interfering agent 4. BCA(Bicinchoninic acid) assay 1) advantage - single reagent, stable end product, fewer interfering substances than Lowry 2) disadvantage - slow reaction time(30min at 37℃), proteins irreversibly denatured 3) detection range - standard assay : 10-1200μg/ml - microassay : 0.5-10μg/ml 4) comment - lipid : spuriously high absorbances 5. Dot filter binding assay - preliminary determination of protein content in a large number of samples >Western을 하기 위해 protein을 정량하려고 하는데 >지금까지는 Gel에 loading을 해서 band의 밝기정도를 보고 판단했는데 >하면서 늘 느끼던 것이 너무 오차가 클 것 같다는 느낌과 >너무 시각에만 의존해서 부정확할 것 같다는 생각이 들었습니다. > >그래서 표준 용액 곡선 방법인 >Bradford 시약과 BSA를 가지고 spectrophotometer를 찍어봤는데 >자꾸 층이 나뉘어 지면서 spec값이 아예 나오질 않네요... > >ELISA를 사용하는 방법 외엔 Protein정량 하는 방법이 없는지... > >여러분이 사용하는 정량법은 어떤 것들이 있는지 좀 알려주시겠어요?^^; > >그럼 좋은 하루 마감하세요....('ㅡ')/
    학위과정 때 Protein Methods란 책의 내용을 기반으로 정리해 놓은 것인데 한번 참고해보세요...“Protein Methods“는 단백질 관련 실험 내용을 쉽게 잘 정리해 놓은 책이니 참고해 보세요... 그리고 용어상에서 ELISA를 사용하는 방법이라는 표현을 조금 어색한 것 같습니다. Microtiter plate format으로 단백질 정량분석을 하시는 것 같은데 아마 사용하시는 plate가 ELISA용 plate이거나 분석기기가 ELISA reader이겠지요... 1. Absorbance at 280nm (A280) 1) advantage - direct, rapid, nondestructive method 2) disadvantage - not strictly quantitative (strong absorbance of tyrosine, phenylalanine, and tryptophan residues / varying extinction coefficients of different proteins) - strong interference by nucleic acid 3) detection range : 0.2 - 2mg/ml (~0.05mg/0.1ml) 4) typical use : generating a protein elution profile after column chromatography 2. Bradford assay 1) advantage - rapid (10min), sensitive (little protein must be sacrificed) - few interfering substances 2) disadvantage - some variability in response between different purified proteins, unstable end product - proteins irreversibly denatured 3) detection range : 25-200μg/ml (2.5μg/0.1ml) 4) comment - color development : fully developed after 5min precipitation start : 10 -15min (acidic condition에서 protein은 ppt하려는 경향이 있기 때문에 고농도에서 더욱 ppt가 잘 일어남) 3. Lowry assay 1) advantage - reliable method, little variation among different proteins 2) disadvantage - many interfering substances, slow reaction rate, instability of certain reagents, proteins irreverisbly denatured 3) detection range : 5μg/ml - 100μg/ml 4) comment - color development : maximum in 20 -30min gradual loss of signal at about 1%/hr - problem : interfering agent 4. BCA(Bicinchoninic acid) assay 1) advantage - single reagent, stable end product, fewer interfering substances than Lowry 2) disadvantage - slow reaction time(30min at 37℃), proteins irreversibly denatured 3) detection range - standard assay : 10-1200μg/ml - microassay : 0.5-10μg/ml 4) comment - lipid : spuriously high absorbances 5. Dot filter binding assay - preliminary determination of protein content in a large number of samples >Western을 하기 위해 protein을 정량하려고 하는데 >지금까지는 Gel에 loading을 해서 band의 밝기정도를 보고 판단했는데 >하면서 늘 느끼던 것이 너무 오차가 클 것 같다는 느낌과 >너무 시각에만 의존해서 부정확할 것 같다는 생각이 들었습니다. > >그래서 표준 용액 곡선 방법인 >Bradford 시약과 BSA를 가지고 spectrophotometer를 찍어봤는데 >자꾸 층이 나뉘어 지면서 spec값이 아예 나오질 않네요... > >ELISA를 사용하는 방법 외엔 Protein정량 하는 방법이 없는지... > >여러분이 사용하는 정량법은 어떤 것들이 있는지 좀 알려주시겠어요?^^; > >그럼 좋은 하루 마감하세요....('ㅡ')/
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    박성철님의 답변

    protein이냐 peptide냐에 따라 달라지며 잔기를 어떻게 구성하고 있느냐에 따라 달라집니다. protocol을 첨부하니 참고하시기를... 그리고 Guide to protein purification (methods in enzymology)책을 참고하심이 어떨지요. 개인적으로 protein과 peptide 두 경우 BCA방법을 추천합니다. 그러나 detergent나 다른 방해인자들이 있으면 Bensadoun method를 추천합니다. 거의 영향을 받지않습니다. >Western을 하기 위해 protein을 정량하려고 하는데 >지금까지는 Gel에 loading을 해서 band의 밝기정도를 보고 판단했는데 >하면서 늘 느끼던 것이 너무 오차가 클 것 같다는 느낌과 >너무 시각에만 의존해서 부정확할 것 같다는 생각이 들었습니다. > >그래서 표준 용액 곡선 방법인 >Bradford 시약과 BSA를 가지고 spectrophotometer를 찍어봤는데 >자꾸 층이 나뉘어 지면서 spec값이 아예 나오질 않네요... > >ELISA를 사용하는 방법 외엔 Protein정량 하는 방법이 없는지... > >여러분이 사용하는 정량법은 어떤 것들이 있는지 좀 알려주시겠어요?^^; > >그럼 좋은 하루 마감하세요....('ㅡ')/
    protein이냐 peptide냐에 따라 달라지며 잔기를 어떻게 구성하고 있느냐에 따라 달라집니다. protocol을 첨부하니 참고하시기를... 그리고 Guide to protein purification (methods in enzymology)책을 참고하심이 어떨지요. 개인적으로 protein과 peptide 두 경우 BCA방법을 추천합니다. 그러나 detergent나 다른 방해인자들이 있으면 Bensadoun method를 추천합니다. 거의 영향을 받지않습니다. >Western을 하기 위해 protein을 정량하려고 하는데 >지금까지는 Gel에 loading을 해서 band의 밝기정도를 보고 판단했는데 >하면서 늘 느끼던 것이 너무 오차가 클 것 같다는 느낌과 >너무 시각에만 의존해서 부정확할 것 같다는 생각이 들었습니다. > >그래서 표준 용액 곡선 방법인 >Bradford 시약과 BSA를 가지고 spectrophotometer를 찍어봤는데 >자꾸 층이 나뉘어 지면서 spec값이 아예 나오질 않네요... > >ELISA를 사용하는 방법 외엔 Protein정량 하는 방법이 없는지... > >여러분이 사용하는 정량법은 어떤 것들이 있는지 좀 알려주시겠어요?^^; > >그럼 좋은 하루 마감하세요....('ㅡ')/
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    DELETED님의 답변

    >Western을 하기 위해 protein을 정량하려고 하는데>지금까지는 Gel에 loading을 해서 band의 밝기정도를 보고 판단했는데>하면서 늘 느끼던 것이 너무 오차가 클 것 같다는 느낌과>너무 시각에만 의존해서 부정확할 것 같다는 생각이 들었습니다.>>그래서 표준 용액 곡선 방법인 >Bradford 시약과 BSA를 가지고 spectrophotometer를 찍어봤는데>자꾸 층이 나뉘어 지면서 spec값이 아예 나오질 않네요...>>ELISA를 사용하는 방법 외엔 Protein정량 하는 방법이 없는지...>>여러분이 사용하는 정량법은 어떤 것들이 있는지 좀 알려주시겠어요?^^;>>그럼 좋은 하루 마감하세요....('ㅡ')/ Re: detergent의 영향을 받는경우가 종종 있습니다. 이런경우, BCA 정량을 보통 수행합니다.
    >Western을 하기 위해 protein을 정량하려고 하는데>지금까지는 Gel에 loading을 해서 band의 밝기정도를 보고 판단했는데>하면서 늘 느끼던 것이 너무 오차가 클 것 같다는 느낌과>너무 시각에만 의존해서 부정확할 것 같다는 생각이 들었습니다.>>그래서 표준 용액 곡선 방법인 >Bradford 시약과 BSA를 가지고 spectrophotometer를 찍어봤는데>자꾸 층이 나뉘어 지면서 spec값이 아예 나오질 않네요...>>ELISA를 사용하는 방법 외엔 Protein정량 하는 방법이 없는지...>>여러분이 사용하는 정량법은 어떤 것들이 있는지 좀 알려주시겠어요?^^;>>그럼 좋은 하루 마감하세요....('ㅡ')/ Re: detergent의 영향을 받는경우가 종종 있습니다. 이런경우, BCA 정량을 보통 수행합니다.
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