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지식나눔

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Subcellular fractionation할 때요...

2005-12-01 org.kosen.entty.User@72df918f 서강식(sks1379)
  • 2
AIF와 cytochrome C를 western blot으로 보기 위해 colon cancer cell을 Nuclei, Mitochondria, Cytosol fraction으로 나누려 합니다. 그런데 여기저기서 알아본 protocol 중 가장 적합하다 싶을 것으로 fractionation을 하려 해도 각 fraction이 제대로 나뉘어졌는지 확인할 방법을 아직 찾지 못해 고민입니다. 특히 cell을 buffer를 넣고 Dounce homogenizer로 깬 다음 760g로 10분간 돌려서 Nuclei를 가라앉힐때 일부 깨지지 않은 cell들도 함께 가라앉는다고 들었습니다. 이것을 가지고 western을 하게 되면 깨지지 않은 cell들의 mitochondria와 cytosol까지 함께 detection되게 될텐데 핵만 나뉘어 졌는지 확인할 방법이 있는지 궁금합니다. 그 외에도 파워풀(?)한 subcellular fractionation을 할 수 있는 방법이 있다면 좀 가르쳐주십시오.
  • AIF
  • cytochrome C
  • subcellular fractionation
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답변 2
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    우하나님의 답변

    2005-12-02
    • 0
    두가지 확인 방법을 제시해 드립니다. 경험에서 나온 것이니 도움이 되시리라 생각합니다. 첫번째로, homogenizer로 세포를 깰 때, 충분히 깼다는 생각이 들더라도 현미경 하에서 정말 다 깨졌는지 확인해주세요. cell count 할 때처럼 놓고 보면 됩니다. 세포가 덜 깨졌을때는 동그란 모양의 세포가 보일것이고, 거의 다 깨졌으면 안 보일 것입니다. fractionation을 하고 있는 전체 세포에 비해 현미경상에서 확인할 때는 매우 조금 따서 보는 것이므로 여기서 둥근세포모양이 많이 보인다면 전체적으로 덜 깨진 세포가 매우 많다고 생각하시면 됩니다. 그러니 둥근 세포가 없을 때까지 확실하게 깨는 것이 중요합니다. 깨진 세포들은 찌꺼기처럼 보입니다. 두번째로, 그렇게 깼다고 하더라도, 실제로 data로 쓰려면 각 fraction이 확실히 분리되었음을 보여줘야 하므로, 각 fraction에 대한 marker로 western blot을 해야합니다. 여러가지 protein이 marker로 쓰이지만 보통 nucleus는 lamin 같은 것, mitochondria는 cytochrome c oxidase나 heatshock protein 60 등, 그리고 cytosol은 IkB 같은 것을 많이 쓰구요. fractionation data가 나와있는 논문을 좀 보시면 그 외에도 많이 쓰는 적당한 marker를 찾으실 수 있을 것입니다.
    답변수정
    두가지 확인 방법을 제시해 드립니다. 경험에서 나온 것이니 도움이 되시리라 생각합니다. 첫번째로, homogenizer로 세포를 깰 때, 충분히 깼다는 생각이 들더라도 현미경 하에서 정말 다 깨졌는지 확인해주세요. cell count 할 때처럼 놓고 보면 됩니다. 세포가 덜 깨졌을때는 동그란 모양의 세포가 보일것이고, 거의 다 깨졌으면 안 보일 것입니다. fractionation을 하고 있는 전체 세포에 비해 현미경상에서 확인할 때는 매우 조금 따서 보는 것이므로 여기서 둥근세포모양이 많이 보인다면 전체적으로 덜 깨진 세포가 매우 많다고 생각하시면 됩니다. 그러니 둥근 세포가 없을 때까지 확실하게 깨는 것이 중요합니다. 깨진 세포들은 찌꺼기처럼 보입니다. 두번째로, 그렇게 깼다고 하더라도, 실제로 data로 쓰려면 각 fraction이 확실히 분리되었음을 보여줘야 하므로, 각 fraction에 대한 marker로 western blot을 해야합니다. 여러가지 protein이 marker로 쓰이지만 보통 nucleus는 lamin 같은 것, mitochondria는 cytochrome c oxidase나 heatshock protein 60 등, 그리고 cytosol은 IkB 같은 것을 많이 쓰구요. fractionation data가 나와있는 논문을 좀 보시면 그 외에도 많이 쓰는 적당한 marker를 찾으실 수 있을 것입니다.
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  • 답변

    DELETED님의 답변

    2010-01-09
    • 0
    >AIF와 cytochrome C를 western blot으로 보기 위해 colon cancer cell을 >>Nuclei, Mitochondria, Cytosol fraction으로 나누려 합니다. >>그런데 여기저기서 알아본 protocol 중 가장 적합하다 싶을 것으로>>fractionation을 하려 해도 각 fraction이 제대로 나뉘어졌는지 확인할>>방법을 아직 찾지 못해 고민입니다. 특히 cell을 buffer를 넣고 Dounce>>homogenizer로 깬 다음 760g로 10분간 돌려서 Nuclei를 가라앉힐때>>일부 깨지지 않은 cell들도 함께 가라앉는다고 들었습니다. 이것을 가지고>>western을 하게 되면 깨지지 않은 cell들의 mitochondria와 cytosol까지>>함께 detection되게 될텐데 핵만 나뉘어 졌는지 확인할 방법이 있는지>>궁금합니다. 그 외에도 파워풀(?)한 subcellular fractionation을 할 수 >>있는 방법이 있다면 좀 가르쳐주십시오. > Re: 기본적으로 핵과 세포질은 hypotonic sol으로 freezig thawing으로 쉽게 분리할수 있습니다.
    답변수정
    >AIF와 cytochrome C를 western blot으로 보기 위해 colon cancer cell을 >>Nuclei, Mitochondria, Cytosol fraction으로 나누려 합니다. >>그런데 여기저기서 알아본 protocol 중 가장 적합하다 싶을 것으로>>fractionation을 하려 해도 각 fraction이 제대로 나뉘어졌는지 확인할>>방법을 아직 찾지 못해 고민입니다. 특히 cell을 buffer를 넣고 Dounce>>homogenizer로 깬 다음 760g로 10분간 돌려서 Nuclei를 가라앉힐때>>일부 깨지지 않은 cell들도 함께 가라앉는다고 들었습니다. 이것을 가지고>>western을 하게 되면 깨지지 않은 cell들의 mitochondria와 cytosol까지>>함께 detection되게 될텐데 핵만 나뉘어 졌는지 확인할 방법이 있는지>>궁금합니다. 그 외에도 파워풀(?)한 subcellular fractionation을 할 수 >>있는 방법이 있다면 좀 가르쳐주십시오. > Re: 기본적으로 핵과 세포질은 hypotonic sol으로 freezig thawing으로 쉽게 분리할수 있습니다.
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