2006-01-23
org.kosen.entty.User@d1edb4c
임채진(kwcl)
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실험에 사용할 펩타이드의 PK를 보기위해서 rat에 injection후에 시간별로 sampling해서 sandwich ELISA로 정량하려합니다.
자체 제작한 두가지 polyclonal 항체를 사용하고, 하나는 capture하는데, 다른 하나는 HRP labeling해서 assay에 사용하고 있습니다.
사용하는 펩타이드를 dilution buffer로 희석해서는 괜찮은 정량 profile을 보여주고있는데, serum내의 펩타이드의 농도는 serum에 의한 interference가 있어서 그런지 맞지않게 나오네요.
1. capture에는 100mM sodium bicarbonate, pH 9.6을 washing은 PBS-T (tween-20 0.05%), blocking은 0.5% BSA in PBS-T로 했는데 다른 buffer가 사용되야할지요?
2. serum을 넣고 binding 시킬 때 shaking을 하지않았는데 해야할지요?
(washing할 때는 shaking을 했고요..~~)
3. monoclonal을 만들어서 사용해야할지요?
4. serum내의 펩타이드만 분리해서 사용해야할지요? 이때의 방법으로 적당한 것은 무엇이 있을지요?
고언 부탁드립니다.
- sandwich ELISA
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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답변
전주홍님의 답변
2006-01-23- 0
정확한 실험 조건을 제가 잘 몰라서 임의로 답변을 달았습니다. 한가지는 순순한 펩타이드를 연속 희석해서 log scale로 x축을 잡고 OD값을 역시 log scale로 y축을 잡습니다. 펩타이드가 포함된 serum 또한 연속 희석해서 똑 같은 방법으로 plotting을 했을 때, slope가 동일하게 나와야만 분석법이 제대로 확립이 되었다고 볼 수 있겠지요... 사용하는 펩타이드를 dilution buffer로 희석해서는 괜찮은 정량 profile을 보여주고있는데, -> 펩타이드를 연속 희석했을 때 dilution test의 typical curve pattern이 잘 나온다는 말씀이시죠? serum내의 펩타이드의 농도는 serum에 의한 interference가 있어서 그런지 맞지않게 나오네요. -> dilution test의 curve pattern이 잘 나오지 않는다는 말씀이시죠? 일단 Control serum에서 어느정도의 background activity가 관찰되는지요? Blocking solution의 농도를 5%정도 되어야 background가 상당히 줄어드는 경우는 많이 있습니다. 어떤 경우엔 BSA보다는 Casein이나 gelatin 등이 훨씬 background를 줄이기도 합니다. Serum은 어느정도 희석해서 사용하시는 지요? monoclonal을 만들어서 사용해야할지요? ->검량선이 잘 나오고 serum에 자체의 background activity가 크지 않다면 poly-poly system도 괜찮을 것 같은데요... serum내의 펩타이드만 분리해서 사용해야할지요? ->펩타이드만 분리하실 거면 HPLC 분석법을 바로 적용하는 것에는 문제가 있는지요? 제가 고수는 아니지만 조금 더 디스커션이 이루어 졌으면 좋겟네요... -
답변
김기윤님의 답변
2006-01-24- 0
저도 잘은 모르지만, 전에 비슷한 실험을 했던지라... coting이나 blocking은 별 무리가 없을 듯 하지만, 단 bocking은 누구 말대로 3~5%로 해서 조건을 잡으시는게 좋을 듯 합니다. serum 넣고는 binding시킬 때 shaking은 안해도 별 상관없으리라 봅니다. 96well plate로 실험하셨을텐데 그 작은 well이 shaking될래면 무지 높은 rpm으로 돌려야 할겁니다. 전 shaking 안해도 그런대로 잘 나온거 같았습니다. 가능하면 capture나 detection이나 MAb를 구입해서 사용하시길 권합니다. 아무래도 polyclonal Ab에 sample도 serum이면 그만큼 background도 심할테니까요. 실례로 제가 했던 실험은 논문같은데서는 PK가 4분정도라고 나왔는데, 저의 실험에서는 20~30분 이상이 나왔습니다. 제가 참고했던 논문과의 차이는 MAB와 PAb의 차이였습니다. 이상의 조건이면 구지 serum내 peptide를 분리할 필요는 없을거 같은데요. 그러려면 그만큼 loss가 생길테니.. >실험에 사용할 펩타이드의 PK를 보기위해서 rat에 injection후에 시간별로 sampling해서 sandwich ELISA로 정량하려합니다. >자체 제작한 두가지 polyclonal 항체를 사용하고, 하나는 capture하는데, 다른 하나는 HRP labeling해서 assay에 사용하고 있습니다. >사용하는 펩타이드를 dilution buffer로 희석해서는 괜찮은 정량 profile을 보여주고있는데, serum내의 펩타이드의 농도는 serum에 의한 interference가 있어서 그런지 맞지않게 나오네요. >1. capture에는 100mM sodium bicarbonate, pH 9.6을 washing은 PBS-T (tween-20 0.05%), blocking은 0.5% BSA in PBS-T로 했는데 다른 buffer가 사용되야할지요? >2. serum을 넣고 binding 시킬 때 shaking을 하지않았는데 해야할지요? > (washing할 때는 shaking을 했고요..~~) >3. monoclonal을 만들어서 사용해야할지요? >4. serum내의 펩타이드만 분리해서 사용해야할지요? 이때의 방법으로 적당한 것은 무엇이 있을지요? > >고언 부탁드립니다.