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천연물을 이용하여 proteoglycan등의 고분자 물질을 분리하려고 하는데...woocbae님 부탁

2006-02-10 org.kosen.entty.User@4b6d49e 박상민(psm1038)
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천연물을 이용하여 proteoglycan등의 고분자 물질을 분리하려고 합니다 먼저 열수추출 한다음 culumn chromatography를 이용하려고 합니다 이용하려는 resin은 size culumn인 sephadex를 이용하여 작은 분자를 걸러내고 butyl sepharose나 phenyl sepharose의 hydrophobic한 resin으로 소수성분자를 걸러내고 이외 DEAE, Q sepharose등의 이온 컬럼을 사용하려 합니다. 이때 각 resin에 사용할 수 있는 buffer와 붙어 있는 물질을 elution 시킬 수 있는 용매, 기타 PH등의 조건(경우에 따라), 주의 할점등을 좀 가르쳐 주세요 제가 할려고 하는 것은 proteoglycan인데 이 물질의 대략적인 성질은 단백질과 복합된 산성 점액성 다당류로써 그 안에 포함된 당분자가 질소를 가지고 있다. 코어프로테인(coreprotein)이라는 폴리펩티드 사슬 1개에 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)이라는 당사슬이 결합한 구조이다. 분자 속에는 수산기(-OH)가 많기 때문에 많은 양의 물과 결합하며, 쇼크 작용으로부터 조직의 섬유 성분 및 세포 성분을 보호하고 조직 표면에 가해지는 압박 등을 견딜 수 있는 탄성을 갖게 한다. 또 점성이 높아 관절이나 건초(힘줄 표피) 내에서는 윤활유의 역할을 하며, 세포간극과 안구를 채우는 젤리성 물질을 이루고 있다. 또 분자 속에 카르복시기와 젖산기가 들어 있기 때문에 양이온을 끌어당겨 양이온 교환반응을 일으켜 염류를 조절한다. 분자량또한 core protein(분자량 약 40,000)에 각각의 분자량이 20,000이내의 약 150개 정도의 다당류 사슬(keratan sulfate, haparan sulfate)이 공유 결합되어 있는(약 200만~300만) 큰 분자이다. 이러한 대략적인 성질이 있는데 각각에 대하여 제가 위에 적어 놓은 컬럼으로 분리가 가능할까요? 가능하다면 위에 적어 놓은 것좀 가르쳐 주세요
  • culumn
  • proteoglycan
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답변 1
  • 답변

    배우철님의 답변

    2006-02-11
    • 0
    우선 말씀드리고 싶은 것은 제 설명은 참고 수준으로 생각하시라는 것입니다. 제가 지금까지 실험해온 것과 문헌 등을 조사하여 알고 있는 사실이지, 질문하신 분이 생각하는 물질에 정확이 맞는다는 보장은 없습니다. 대부분의 실험들이 case by case이고 그냥 먼저 유사한 실험을 한 사람의 조언 정도로 생각하시면 좋을 것 같습니다. 다만 그 컬럼들을 제대로만 활용하면 가능할 것이라고 생각됩니다. 우선 proteoglycan의 성질에 대한 주요 리뷰 페이퍼가 있으니 참고하시기 바랍니다. Methods Enzymol. 1987;144:319-72. Isolation and characterization of proteoglycans. Heinegard D, Sommarin Y. Methods Enzymol. 1987;144:305-19. Proteoglycans: an overview. Heinegard D, Sommarin Y. Proteoglycan은 다음극성(polyanionic) 특성이 강하다는 점이 분리에서 중요할 것입니다. 이 같이 음전하를 강하게 갖고 있기 때문에 자기들끼리의 이온상호 작용으로 쉽게 뭉쳐서 분자량이 크게 됩니다. 또한 이런 특성 때문이 일반 단백질 분리와는 조금 다른 방식을 활용해야 합니다. 천연물 유래라고 하시니까.. 추출법을 열수 쪽이 좋을 것 같습니다. Sephadex로 소분자 물질 걸러내고 butyl sepharose나 phenyl sepharose의 hydrophobic한 resin으로 소수성 분자를 걸러내는 방식은 좋다고 생각됩니다. 분리 시의 수율을 높이기 위해서는 원하시는 물질만을 대량 얻는 방법을 찾으실 필요가 있습니다. 특히 proteoglycan은 음전하를 강하게 띠니까 anion exchange가 좋은 방법이 아닐까 하고 생각이 듭니다. DEAE 계열의 컬럼에서 이전에 알려드린 설명서의 버퍼 조건에서 NaCl gradient를 0-1M까지 거는 것이 일반적입니다. 또 분자량도 약 200만~300만 정도라는 것을 아시니까.. 이 정도에서 분리가 잘되는 겔여과 컬럼도 활용하실 수 있을 것입니다. 특히 가장 신경을 쓰실 일은 작은 컬럼들을 만들어서 다양한(pH나 salt) 조건에서의 분리능을 확인하고 규모를 키워서 실제 분리를 해야 한다는 점입니다. 이것을 확인하기 위해서는 원하는 물질의 존재를 확인하는 분석법이 우선 있어야 합니다…
    답변수정
    우선 말씀드리고 싶은 것은 제 설명은 참고 수준으로 생각하시라는 것입니다. 제가 지금까지 실험해온 것과 문헌 등을 조사하여 알고 있는 사실이지, 질문하신 분이 생각하는 물질에 정확이 맞는다는 보장은 없습니다. 대부분의 실험들이 case by case이고 그냥 먼저 유사한 실험을 한 사람의 조언 정도로 생각하시면 좋을 것 같습니다. 다만 그 컬럼들을 제대로만 활용하면 가능할 것이라고 생각됩니다. 우선 proteoglycan의 성질에 대한 주요 리뷰 페이퍼가 있으니 참고하시기 바랍니다. Methods Enzymol. 1987;144:319-72. Isolation and characterization of proteoglycans. Heinegard D, Sommarin Y. Methods Enzymol. 1987;144:305-19. Proteoglycans: an overview. Heinegard D, Sommarin Y. Proteoglycan은 다음극성(polyanionic) 특성이 강하다는 점이 분리에서 중요할 것입니다. 이 같이 음전하를 강하게 갖고 있기 때문에 자기들끼리의 이온상호 작용으로 쉽게 뭉쳐서 분자량이 크게 됩니다. 또한 이런 특성 때문이 일반 단백질 분리와는 조금 다른 방식을 활용해야 합니다. 천연물 유래라고 하시니까.. 추출법을 열수 쪽이 좋을 것 같습니다. Sephadex로 소분자 물질 걸러내고 butyl sepharose나 phenyl sepharose의 hydrophobic한 resin으로 소수성 분자를 걸러내는 방식은 좋다고 생각됩니다. 분리 시의 수율을 높이기 위해서는 원하시는 물질만을 대량 얻는 방법을 찾으실 필요가 있습니다. 특히 proteoglycan은 음전하를 강하게 띠니까 anion exchange가 좋은 방법이 아닐까 하고 생각이 듭니다. DEAE 계열의 컬럼에서 이전에 알려드린 설명서의 버퍼 조건에서 NaCl gradient를 0-1M까지 거는 것이 일반적입니다. 또 분자량도 약 200만~300만 정도라는 것을 아시니까.. 이 정도에서 분리가 잘되는 겔여과 컬럼도 활용하실 수 있을 것입니다. 특히 가장 신경을 쓰실 일은 작은 컬럼들을 만들어서 다양한(pH나 salt) 조건에서의 분리능을 확인하고 규모를 키워서 실제 분리를 해야 한다는 점입니다. 이것을 확인하기 위해서는 원하는 물질의 존재를 확인하는 분석법이 우선 있어야 합니다…
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