KOSEN 한인과학기술자네트워크

일단은 DIG labeling DNA의 effiency 실험을 해 보셨는지 궁금하군요. 매뉴얼에 나온대로 DNA labeling해도 실제로는 할때마다 labeling 결과가 다르게 나옵니다. 즉, DNA labeling을 할때마다 effiency test를 하는 것이 제일 중요합니다. 저는 한번에 많은 양의 DNA를 labeling해서 모아서 쓰는데요. 물론 Probe DNA 감도와 대략적인 농도를 확인하기 위한 effiency test를 했구요. 이방법이 실험 오차를 줄일 수 있는 좋은방법이예요. 그리고 Hybridization시 probe DNA의 농도를 얼마나 쓰셨는지요? 매뉴얼에 나온 농도보다는 2~4배가량 높은 농도를 사용해 보세요. 제일 좋은 방법은 Probe DNA를 다양한 농도로 사용해서 band의 생성을 확인하세요. 그리고 film exposure시 film의 선택도 중요합니다. 동위원소가 아닌 chemiluminescence를 이용하므로 이를 잘 검출해내는 film을 사용해 보시구요. exposure시에는 37도에서 10분 배양 후 casette에 끼운 상태로 한 30분쯤 경과한 후 film을 얹고 30분, 1시간, 2시간, o/n으로 여러번 exposure 를 시켜보세요. 좋은 결과가 있을겁니다. 저도 이 실험을 통해 조건을 잡는데 시간이 오래 걸렸어요. 매뉴얼은 참조만 하는 것이지 보증수표가 아니랍니다. 그럼, 좋은 결과 있길 바랍니다. 참, BMS 학술팀에 전화해서 물어보시면 친절히 답변도 해드리니 연락해보세요. >northern을 하고 있는 중인데 dig를 사용해서 lableing하고 있습니다. >여러번 실험을 해도 blot에 밴드가 나타나지 않는군요... >실험해보신분 실험방법 좀 가르쳐 주세요... >저는 roche홈페이지에서 다운받은 프로토콜대로 사용하고 있는데 뭐가 문제인지 모르겠습니다. > >제가 실험한 방법을 설명하자면 > >blot은 실험방법대로 사용해서 했고 > >DNA 1ug되게해서 total 16ul되게해서 boling 10분후 ice, 37도씨 water bath에 2-3시간 둔후 EDTA 첨가한후 65도씨 Incubate에 10분 다시 boling 5분후 ice > >blot은 sealable에 hyb 용액 10ml 첨가 후 50도씨에 30분 두고 용액 버리고 > >hyb 용액 3.5ml에 label DNA를 섞은 후 다시 sealable에 넣고 hyb oven에 O/N > >washing은 1번 step대로 하고 2번 step에서 68도씨에서 한 후 > >플라스틱 통에 blot을 놓고 washing buffer로 잠깐 rinse > >blocking solution 100ml넣고 incubate(42-45도 정도) > >antibody solution 20ml넣고 incubate > >washing buffer 100ml 넣고 washing(2회) > >detection buffer 20ml넣고 3분 > >3MM paper에 blot 올린후 CSPD 1ml 떨어드린후 상온에 5분 두고 > >37도 incubate에 10분 둔후 X-ray film으로 현상합니다.(expose time 15분) > >잘못된게 있는지 보시고 많은 조언 부탁드립니다. > >